槲皮素通过p53-p21-Rb通路缓解慢性阻塞性肺疾病的肺衰老*

高露洋 罗丹 王文军

(西南医科大学附属医院呼吸与危重症医学科,四川 泸州 646000)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一种以持续性气流受限为特征的呼吸系统常见病,早期病变可能仅局限于肺部,但随着病情进展,可逐渐累及全身多个系统[1],具有较高的致残率和致死率。肺是与外界环境相通的器官之一,特别是中老年人,他们暴露于有害气体或粉尘等外界环境的时间更长,同时个体进入老年期后神经体液因子及免疫调节功能等会逐步下降,这将导致肺部结构和功能发生与年龄相关的病理性变化[2],对COPD等慢性肺部疾病的易感性增加[3],使得COPD好发于中老年人,且发病率随着年龄的增长而逐渐升高[4],均提示衰老与COPD等年龄相关性疾病的发生发展密切相关。目前临床上COPD的治疗药物以支气管扩张剂、糖皮质激素等为主,然而这些药物只能缓解症状,不能抑制疾病进展[5]。COPD作为一种肺部加速衰老的疾病,肺中衰老细胞的积累会进一步促进疾病进展[6],清除衰老细胞可能是防治COPD的有效方法。抗衰老药物(Senolytics)是一类能够清除衰老细胞的化合物,已被发现的药物有白藜芦醇、槲皮素、非瑟酮、雷帕霉素、二甲双胍、达沙替尼等[7]。槲皮素(Quercetin,Q)是一种自然界广泛存在的黄酮类化合物,作为抗衰老药物之一[8],其可有效清除衰老的巨噬细胞和脂肪细胞[9-10]。然而槲皮素能否通过减少COPD患者肺内的衰老细胞改善COPD病情进展尚不清楚。因此,本研究通过构建COPD小鼠模型,观察槲皮素是否对COPD小鼠肺组织具有抗衰老的作用,并研究其可能的机制,从而为COPD的临床治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物 30只清洁级C57BL/6雄性小鼠,6～8周龄,体重20～25 g,自由饮水和进食,待适应性喂养一周后开始进行实验。实验方案通过动物伦理委员会批准,动物使用许可证号:SYXK(川)2018-17。

1.2 主要试剂 槲皮素、脂多糖(Lipase, LPS)(美国MCE公司);HE染色液(美国sigma公司);SA-β-gal染色试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司);Bcl-2抗体、Bax抗体(美国Abcam公司);RIPA裂解液、BCA试剂盒、ECL化学发光试剂盒(武汉阿斯本生物技术有限公司);兔抗p53抗体(武汉三鹰生物技术有限公司)、兔抗p21抗体(美国Abcam公司)、兔抗Rb抗体(美国CST公司)、兔抗β-actin抗体(武汉科鹿生物科技有限责任公司)、山羊抗兔HRP标记的IgG二抗(武汉阿斯本生物技术有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 COPD小鼠动物模型建立及分组 将小鼠随机分为对照组、模型组、槲皮素组,每组10只。模型组和槲皮素组采用烟熏联合气道内滴注LPS的方法建立COPD小鼠模型,具体方法参考文献[11]。在造模的第1、14 d气管内滴入脂多糖(25 μg/50 μL),第2 ～30 d(除第14 d)进行被动吸烟,将小鼠放入烟熏装置中,每次10支香烟,每天2次,每次持续30 min(两次间隔4 h以上),共烟熏28 d。对照组在第1 d和第14 d经气道内滴入相同量的生理盐水,不做烟熏处理。通过肺组织HE染色判断是否造模成功[12]。若实验过程中造模失败或有小鼠死亡,则重新补齐小鼠维持每组样本量为10只。

1.3.2 给药方式 造模成功后,槲皮素组给予槲皮素(50 mg/kg)灌胃给药,1次/d,持续4周。对照组和模型组接受等体积生理盐水溶液灌胃。

1.3.3 HE染色观察小鼠肺组织病理变化 麻醉所有小鼠并处死,取出小鼠的左肺组织用4%多聚甲醛固定24 h,再用乙醇梯度脱水,包埋在石蜡中,制成厚度为2～3 μm的组织玻片标本。采用HE染色,中性树胶封片,在光镜下观察组织切片,并进行肺组织病理损伤评分[13]。评分指标:①支气管粘膜上皮纤毛病变:粘连、倒伏或脱失。②支气管粘膜上皮病变:糜烂、脱落或鳞化。③支气管粘膜杯状细胞增生情况。④支气管壁炎性细胞浸润。⑤肺泡腔内炎性渗出。⑥肺泡气肿或萎陷。评分标准:根据病变程度分为正常、轻度异常、中度异常、重度异常,分别评为0、1、2、3分。每个切片任取5个视野,根据以上指标对观察到的病变进行评分,将各项分值相加,即为每个标本得分总分。

1.3.4 衰老相关β-半乳糖苷酶染色(SA-β-gal染色)法 将肺组织用4%多聚甲醛固定24 h后,再用30%蔗糖溶液4 ℃低温脱水,取出后用OCT包埋剂在-40 ℃冷冻包埋后进行冰冻切片;取一张肺组织的冰冻组织切片室温复温,PBS洗涤后用β-gal染色固定液室温固定,倾去固定液,PBS洗3次,每次5 min,滴加适量的β-gal染色工作液(A液10 μL+B液体10 μL+C液930 μL +X-Gal溶液50 μL),37 ℃孵育过夜后,倾去工作液,PBS洗后封片,将切片置于光镜(200×)下观察组织染色,蓝染面积为阳性面积,每张切片随机选择5个视野,用Image-Pro Plus分析系统测定阳性面积的积分光密度(IOD)。

1.3.5 免疫组化染色检测各组小鼠Bcl-2、Bax蛋白的表达 将肺组织用4%多聚甲醛固定24 h后取出,经脱水后进行石蜡包埋切片,肺组织的石蜡切片进行脱蜡和水化处理后,用柠檬酸盐缓冲液进行热抗原修复,冷却至室温后PBS洗3次,每次5 min,加3%的过氧化氢溶液封闭内源性过氧化氢酶,PBS洗3次,每次5 min,再进行一抗4 ℃过夜,二抗37 ℃孵育30 min,加入DAB显色,最后用苏木精复染后进行脱水封片。在光镜下观察呈棕黄色的阳性细胞,每张切片随机选择5个视野,采用Image-Pro Plus分析系统测定视野内阳性细胞的积分光密度(IOD)。

1.3.6 Western blot检测各组小鼠肺组织p53、p21、Rb蛋白的表达 将3组的肺组织用PBS清洗3次,加入蛋白裂解液裂解提取总蛋白,使用BCA试剂盒测定样品蛋白浓度。配制适宜浓度的SDS-PAGE胶,随后进行上样、电泳、转膜、封闭,在4 ℃条件下孵育一抗过夜,用TBST洗3次后加入二抗室温孵育1 h,最后滴加ECL进行曝光显影。用AlphaEaseFC软件对目的条带和内参条带的灰度值进行量化分析,并计算目的条带和内参条带灰度值的比值。

2 结果

2.1 各组小鼠肺组织病理学表现 HE染色结果显示,对照组可见肺泡结构正常完整,支气管形态规则,支气管黏膜柱状上皮细胞排列整齐,无杯状细胞增生,管壁未见变厚,未见炎性细胞浸润;模型组可见肺泡结构被破坏,肺泡腔内可见大量炎症细胞浸润和出血,支气管管腔变形,管壁增厚,支气管黏膜上皮变性、坏死或脱落,杯状细胞增多,管壁周围有大量炎症细胞浸润;槲皮素组肺组织损伤程度较模型组减轻(见图1)。对照组、模型组、槲皮素组肺组织损伤评分分别为(1.40±0.55)分 、(12.00±1.58)分 、(7.20±0.84)分,经方差分析,差异均有统计学意义(F=120.743,P<0.001)。进一步两两比较结果:与对照组比较,模型组小鼠肺组织损伤评分显著升高(P<0.05);与模型组比较,槲皮素组小鼠肺组织损伤评分均显著降低(P<0.05),见图2。

图1 各组小鼠肺组织HE染色病理学表现(标尺=100 μm)Figure 1 Pathological changes of mice lung tissue in each group

图2 各组小鼠肺组织损伤评分Figure 2 Lung tissue injury scores of mice in each group注:与对照组相比, ①P<0.05;与模型组相比,②P<0.05。

2.2 各组小鼠肺组织衰老相关-β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色阳性面积半定量分析 衰老细胞经SA-β-gal染色后呈蓝色,在光镜下观察切片组织蓝染的阳性细胞(见图3)。与对照组相比,模型组蓝染阳性面积IOD值明显增加(P<0.05);与模型组相比,槲皮素组阳性面积显著减少(P<0.05),这说明槲皮素能有效延缓肺组织的衰老。见表1。

表1 各组小鼠肺组织SA-β-gal染色阳性面积IOD值Table 1 IOD value of SA-β-gal staining area of mice lung tissue in each group

图3 各组小鼠肺组织SA-β-gal染色(200×)Figure 3 SA-β-gal chemical staining of mice lung tissue in each group

2.3 各组小鼠肺组织中Bcl-2、Bax蛋白的表达 与对照组相比,模型组小鼠肺组织中Bcl-2表达明显下降、Bax蛋白表达明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,经给药处理后,槲皮素组小鼠肺组织中Bcl-2表达显著升高,而Bax蛋白表达降低(P<0.05)。见图4、表2。

表2 各组小鼠肺组织Bcl-2、Bax蛋白表达的IOD值Table 2 IOD value of Bcl-2 and Bax protein expression in mice lung tissue of each group

图4 各组小鼠肺组织Bcl-2、Bax蛋白免疫组化染色(200×)Figure 4 Immunohistochemical staining of Bcl-2 and Bax proteins in mice lung tissues of each group注:Bcl-2、Bax蛋白表达于胞质,阳性细胞呈棕黄色。

2.4 各组小鼠肺组织中p53、p21、Rb蛋白的相对表达量 各组小鼠肺组织中p53、p21、Rb蛋白的相对表达量比较,经方差分析,差异均有统计学意义(P<0.05)。进一步两两比较:与对照组相比,模型组小鼠肺组织中p53、p21、Rb蛋白相对表达量均明显增高(P<0.05);槲皮素组中小鼠肺组织中p53、p21、Rb蛋白相对表达量均低于模型组(P<0.05)。见表3、图5。

表3 各组小鼠肺组织 p53、p21、Rb蛋白的相对表达量Table 3 Expression of protein p53, p21 and Rb in each group

图5 各组衰老相关蛋白western blot检测Figure 5 Western blot detects expression of aging-related protein p53, p21, Rb注:A.对照组;B.模型组;C.槲皮素组。

3 讨论

COPD是一种严重危害人类健康的常见慢性疾病,已成为全球第三大死因,COPD的发病率随着年龄的增加呈上升趋势[14],常常与其他年龄相关的疾病同时存在,如动脉粥样硬化、2型糖尿病、慢性肾脏病、骨质疏松等[15-16],严重影响患者心理[17]及身体健康,且衰老对许多年龄相关疾病的发生发展具有一定影响。研究[18-19]发现,在COPD肺中气道上皮细胞、肺泡上皮细胞等多种细胞中均显示出细胞衰老增加,这说明细胞衰老在COPD的发病机制中起到至关重要的作用。研究[20]发现,在衰老小鼠模型中使用抗衰老药物,能够有效清除衰老细胞,从而起到治疗作用。目前COPD仍缺乏有效的治疗手段。因此,在COPD中给予抗衰老治疗可能是一种很有潜力的治疗方法。抗衰老药物槲皮素联合达沙替尼可通过消除衰老细胞改善小鼠与年龄相关的功能障碍并延长寿命[21],但目前联合用药的安全性尚不明确,槲皮素联合达沙替尼使用仍为时过早[22]。近年来研究发现槲皮素单一用药仍具有抗衰老的作用,在体内和体外实验中已得到了验证。在体外,槲皮素可清除衰老的人类主动脉内皮细胞减轻动脉粥样硬化[23];在体内,其也可以通过减少肺中的衰老细胞改善博莱霉素诱导的老年小鼠肺纤维化[24]。本研究首先通过烟熏和气道内滴注脂多糖构建COPD小鼠模型,并连续4周给予槲皮素以探究其对肺衰老的治疗作用及可能机制。HE染色结果显示,模型组小鼠肺泡结构被破坏,肺泡腔内可见大量炎症细胞浸润和出血,支气管黏膜上皮变性、坏死或脱落,杯状细胞增多,支气管管壁增厚,周围有大量炎症细胞浸润,且模型组小鼠肺组织损伤评分显著升高,均提示COPD小鼠模型构建成功。SA-β-gal作为细胞衰老的标志之一,在衰老细胞中表达升高[25],模型组小鼠肺组织经SA-β-gal染色后的蓝染阳性面积较对照组小鼠明显增加,证实了COPD小鼠肺组织发生了衰老。给予槲皮素进行干预后,发现小鼠肺组织结构破坏程度和炎性细胞浸润程度明显减轻,小鼠肺组织病理损伤明显减轻,SA-β-gal染色的阳性面积减少,但不能完全恢复到对照组的状态,表明槲皮素只能起到缓解肺损伤、延缓衰老的作用。

细胞衰老与细胞凋亡是紧密相关的。Bcl-2蛋白家族介导细胞凋亡过程,Bcl-2是重要的抗凋亡蛋白,能阻遏细胞凋亡的发生,使得细胞存活;Bax为促凋亡蛋白,当其表达过量时,可促进凋亡的发生[26]。有研究发现,衰老小鼠的Bcl-2表达减少、Bax表达增加,这会促进细胞凋亡,使得组织功能受损。本研究结果显示,与对照组相比,模型组的Bcl-2蛋白表达下降、Bax蛋白表达增高;给予槲皮素后能上调Bcl-2蛋白表达,下调Bax蛋白表达,说明槲皮素能够有效抑制肺内的细胞凋亡,改善肺组织的结构和功能。

p53-p21-Rb信号通路是重要的细胞衰老信号传导通路[27],p53是一种细胞周期调节剂,衰老状态下,它可以激活下游的p21分子,而p21又能抑制CDK2/CyclinE复合体,使得磷酸化的pRb蛋白转变为去磷酸化的Rb蛋白。去磷酸化的Rb蛋白结合转录因子E2F,抑制了E2F下游的基因转录,从而使阻滞细胞进入S期,使细胞退出细胞周期,启动细胞衰老过程[28-29]。本研究显示,与对照组比较,COPD模型组小鼠肺组织的p53、p21、去磷酸化Rb蛋白表达显著增加,槲皮素能显著降低p53、p21、Rb蛋白的表达,提示槲皮素可以下调p53-p21-Rb衰老信号通路,说明槲皮素缓解COPD小鼠肺衰老的机制可能与p53-p21-Rb信号通路有关。

4 结论

槲皮素可通过下调p53-p21-Rb信号通路,减轻肺组织病理损伤,抑制肺组织细胞凋亡,延缓肺组织的衰老,从而起到治疗COPD的作用。