血清GSDMD、ACE2在小儿川崎病中的表达水平及临床意义研究*

范泽卫,李 荟,李竹青

临汾市人民医院儿科,山西临汾 041000

川崎病(KD)是儿童较为常见的皮肤黏膜淋巴结综合征[1]。KD主要表现为不明原因的持续发热,口唇及口腔黏膜受损,病理上表现为全身性血管炎症,可引起冠状动脉损伤(CAL),发展为持续性动脉瘤和冠状动脉扩张,危及患儿生命[2]。深入研究KD患儿疾病机制,寻找能够评估CAL发生的血清标志物,对于患儿临床早期诊治具有重要意义。焦孔素蛋白D(GSDMD)属于焦孔素蛋白家族成员,是细胞焦亡途径中的关键执行分子。有研究表明,GSDMD通过调控免疫细胞的死亡及白细胞介素1β等炎症因子的释放,促进动脉粥样硬化、糖尿病心肌病等心血管疾病疾病的进展[3-4]。血管紧张素转化酶2(ACE2)是一种血管紧张素转化酶,主要表达于内皮细胞、心肌细胞及心肌成纤维细胞,参与调节一氧化氮的释放及血管内皮功能[5]。近年来发现,KD患儿血管内皮损伤后能够促进ACE2释放到血清中,是潜在的KD血管损伤的生物标志物[6]。目前KD患儿血清GSDMD、ACE2表达及与CAL的关系尚不清楚。本研究通过检测KD患儿血清GSDMD、ACE2水平,探讨二者在评估KD患儿发生CAL的临床价值。现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2020年1月至2022年1月本院诊治的90例KD患儿为KD组,根据KD患儿是否发生CAL,将KD组又分为CAL组(32例),非CAL组(58例)。纳入标准:(1)KD诊断符合美国心脏病学会《川崎疾病诊断指南》标准[7];(2)超声心动图中存在冠状动脉瘤或冠状动脉扩张则诊断为CAL,冠状动脉扩张的标准:患儿年龄<3岁时冠状动脉内径>2.5 mm;3～9岁时冠状动脉内径>3.0 mm;>9～14岁时冠状动脉内径>3.5 mm;(3)患儿病情处于急性期;(4)首次诊治,既往无丙种球蛋白等治疗史;(5)临床资料完整。排除标准:(1)合并渗出性结膜炎、渗出性咽炎等;(2)合并严重心、肝、肾等脏器功能障碍;(3)接受免疫抑制剂或糖皮质激素等治疗;(4)合并肺炎等感染性疾病。KD组男48例、女42例,年龄7个月至7岁,平均(3.32±0.78)岁。选取同期因急性呼吸道感染发热住本院的患儿50例为发热对照组,其中男27例、女23例,年龄6个月至11岁,平均(3.45±0.69)岁,均无心血管疾病。另选取同期本院儿外科行择期手术的腹股沟斜疝患儿50例为对照组,其中男28例、女22例,年龄7个月至12岁,平均(3.76±0.75)岁。3组性别、年龄比较,差异无统计学意义(均P>0.05)。该研究经医院伦理委员会批准,患儿家属对本研究知情并签字。

1.2方法

1.2.1检测方法 收集KD组和发热对照组患儿入院即刻治疗前,对照组患儿入院后次日清晨空腹静脉血3 mL,室温静置1 h后,3 000 r/min离心10 min,分离上层血清待测。采用酶联免疫吸附试验检测血清GSDMD、ACE2水平。GSDMD酶联免疫吸附试验试剂盒购自上海梵态生物科技公司,货号FT-P37283R。ACE2酶联免疫吸附试验试剂盒购自上海联祖生物科技公司,货号LZ-E028872。严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.2观察指标 收集所有研究对象性别、年龄、发热持续时间、丙种球蛋白治疗时间等临床资料。留取KD组患儿入院后即刻外周血。采用Sysmex公司的XE血球分析仪检测白细胞计数、中性粒细胞百分比及血小板计数。采用TEST1型自动红细胞沉降速率仪(意大利ALIFAX公司)分析红细胞沉降率。采用瑞士罗氏公司Roche Cobasp612全自动生化分析仪及配套试剂检测C反应蛋白、血红蛋白、血钠、丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、白蛋白、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、三酰甘油及总胆固醇。

2 结 果

2.1各组血清GSDMD、ACE2水平比较 3组血清GSDMD、ACE2水平比较,差异有统计学意义(均P<0.05)。KD组血清GSDMD、ACE2水平高于发热对照组和对照组,差异有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

表1 各组血清GSDMD、ACE2水平比较

2.2CAL组与非CAL组临床资料比较 相比于非CAL组,CAL组KD患儿发热持续时间、丙种球蛋白治疗时间、红细胞沉降率、血小板计数、C反应蛋白、GSDMD、ACE2水平均明显较高,而血钠、白蛋白明显较低,差异有统计学意义(均P<0.05)。见表2。

表2 CAL组与非CAL组临床资料比较(n/n或

2.3KD患儿血清GSDMD、ACE2水平与临床指标的相关性分析 Pearson相关分析结果,KD组患儿血清GSDMD、ACE2水平与发热持续时间、丙种球蛋白治疗时间、红细胞沉降率、血小板计数、C反应蛋白呈正相关 (均P<0.05),与血钠、白蛋白呈负相关(均P<0.05)。见表3。

表3 KD患儿血清GSDMD、ACE2水平与临床指标的相关性

2.4多因素Logisitic回归分析KD患者发生CAL的影响因素 以KD患儿是否发生CAL为因变量(1=发生,0=未发生),以血清GSDMD、ACE2为自变量,以发热持续时间、丙种球蛋白治疗时间、红细胞沉降率、血小板计数、C反应蛋白、血钠、白蛋白为协变量,多因素Logistic回归分析结果,血清GSDMD、ACE2升高是影响KD患儿发生CAL的独立危险因素。见表4。

表4 多因素Logisitic回归分析KD患者发生CAL的影响因素

2.5血清GSDMD、ACE2对KD患儿发生CAL的诊断价值 ROC曲线分析结果显示,血清GSDMD、ACE2两项联合检测KD患儿发生CAL的曲线下面积(AUC)及其95%CI为0.918(0.868～0.949),明显大于血清GSDMD、ACE2单项检测的AUC及其95%CI[依次为0.838(0.789～0.887)、0.865(0.811～0.912)],差异有统计学意义(Z=5.116、4.217,P<0.05)。见图1、表5。

图1 血清GSDMD、ACE2及两项联合检测KD患儿发生CAL的ROC曲线

表5 血清GSDMD、ACE2对KD患儿发生CAL的诊断价值

3 讨 论

KD是一种常见于儿童的结缔组织病,是由免疫介导的变态反应性全身性中小血管炎。临床上,KD主要表现为发热、结膜充血、皮疹及淋巴结肿大等,累及全身多个系统,其中以心血管系统的损害,特别是冠状动脉的损害最严重[8]。KD主要依据临床表现进行临床诊断,目前尚无有效的实验室指标,导致部分症状不典型的KD患儿漏诊或误诊,错过应用人免疫球蛋白的最佳时机[9]。深入研究KD疾病机制,对于评估KD患儿病情及改善预后具有重要意义。

KD发生与先天免疫和适应性免疫的激活,大量促炎细胞因子的过度释放有关。近年来研究表明,细胞焦亡在心肌缺血/再灌注损伤及冠心病等心血管疾病中发挥重要作用[10-11]。GSDMD作为细胞焦亡执行者,其表达升高能够加重血管内皮细胞炎症反应,是潜在的KD血清生物标志物[12]。本研究结果显示,KD组血清GSDMD水平高于发热对照组和对照组,差异有统计学意义(P<0.05),并且GSDMD与发热持续时间、红细胞沉降率、C反应蛋白等临床指标有关,提示GSDMD参与KD疾病的发生、发展。单核细胞/巨噬细胞大量释放的肿瘤坏死因子α等促炎细胞因子在急性期KD患儿血管内皮损伤中起着重要作用[13]。有研究表明,肿瘤坏死因子α能够通过激活血管内皮细胞炎症小体依赖性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3,促进GSDMD的剪切和激活,诱导白细胞介素-1β和白细胞介素-18的释放,加重血管炎症反应[14]。本研究结果显示,相比于非CAL组,CAL组KD患儿GSDMD水平明显较高,差异有统计学意义(P<0.05),血清GSDMD升高是影响KD患儿发生CAL的独立危险因素。有学者利用干酪乳杆菌细胞壁提取物诱导的KD小鼠模型中发现,冠状动脉内皮中的NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎症小体被显著激活,并导致白细胞介素1β等促炎因子的分泌增加,诱导冠状动脉血管内皮细胞凋亡、自噬或焦亡性细胞死亡,导致CAL的发生,而在利用溶酶体膜稳定剂或抑制组织蛋白酶B后,抑制NLRP3炎症小体的激活,GSDMD及促炎因子表达明显下调,冠状动脉内皮细胞膜破裂减轻,缓解冠状动脉的炎症反应程度[14]。

ACE2是一种跨膜型锌金属羧肽酶,是ACE的同源结构酶,广泛分布于全身大小动脉及静脉内皮细胞中,在心脑血管疾病中起着重要的病理作用[15-16]。有研究发现,ACE2是新型冠状病毒的关键受体,参与促进内皮细胞功能受损,引发炎症风暴[17]。此外,ACE2与KD的血管内皮损伤有关,KD患儿血管内皮损伤发生,ACE2可以释放到血清中,通过检测血清中ACE2的变化可以评估KD血管损伤的预后[6]。本研究结果显示,KD组血清ACE2水平高于发热对照组和对照组,差异有统计学意义(P<0.05),并且ACE2与发热持续时间、红细胞沉降率、C反应蛋白等临床指标有关,表明血清ACE2的上调可能是KD急性期血管损伤和炎症的重要机制。有研究表明,单核巨噬细胞的活化可通过髓系分化基因88蛋白依赖性和非依赖性途径诱导内皮细胞凋亡,激活核因子κB途径,上调树突状细胞表面Toll样受体4的表达,进而启动炎症细胞因子转录,介导炎症介质分泌及大量活性氧等氧自由基的产生,导致血管内皮细胞炎症及损伤[18-19]。本研究结果显示,相比于非CAL组,CAL组KD患儿ACE2水平均明显较高,差异有统计学意义(P<0.05),且血清ACE2升高是影响KD患儿发生CAL的独立危险因素,表明ACE2可能参与促进KD患儿冠状动脉血管内皮损伤。分析其原因,ACE2水平升高能够促进血小板活化水平,导致KD患儿发生CAL。有研究表明,KD患儿血管内皮上的ACE2脱落到血清中,其丧失拮抗血小板的作用,血小板在血管内皮细胞上聚集,诱导血栓形成,导致血管内皮损伤,引起冠状动脉的过度扩张和血管瘤的形成[20]。因此,ACE2可能在KD急性期的炎症反应和血管损伤中发挥作用,但ACE2引起CAL发生的具体作用机制有待今后深入研究。本研究ROC曲线分析结果显示,血清GSDMD、ACE2两项联合检测KD患儿发生CAL的AUC及其95%CI为0.918(0.868～0.949),灵敏度和特异度分别为0.926、0.775,提示两项联合检测对于KD患儿发生CAL具有较高的诊断价值。临床上,可通过检测血清GSDMD、ACE2水平早期预测、评估KD患儿CAL的情况,同时采取针对性措施及时干预治疗,以改善患儿临床预后。

综上所述,KD患儿血清GSDMD、ACE2升高,两者与发热持续时间、丙种球蛋白治疗时间、红细胞沉降率、血小板计数、C反应蛋白呈正相关,与血钠、白蛋白呈负相关。血清GSDMD、ACE2升高是影响KD患儿发生CAL的独立危险因素。但本研究也存在不足,由于本研究样本量有限,未能对不同CAL程度的KD患儿血清GSDMD、ACE2水平进行分层分析,并且未能动态监测治疗过程中两者的动态变化,有待今后设计前瞻性大样本临床实验进一步研究。