儿童异基因造血干细胞移植100 天后闭塞性细支气管炎综合征临床特点及危险因素分析

孙若楠 李泊涵 郑德菲 赵夏莹 林子云 胡昳歆 高 莉 高 静 李 捷 卢 俊 肖佩芳 潘 健 凌 婧 方 芳 胡绍燕

苏州大学附属儿童医院（江苏苏州 215025）

异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）是儿童高危恶性疾病、先天性免疫缺陷病及骨髓衰竭疾病的重要治疗手段，随着移植技术的日渐成熟，更多的患者得到根治，但与移植后的长期存活及患者的生活质量密切相关的移植晚期并发症也越来越引起临床医师的重视[1]。慢性移植物抗宿主病（chronic graft versus host disease，cGVHD）是移植后晚期的主要并发症，cGVHD中最严重的肺部非感染性并发症是闭塞性细支气管炎（bronchiolitis obliterans，BO）。其中移植后BO 是一类发生在肺移植或造血干细胞移植（HSCT）后的肺部并发症，临床上将这类临床表现、影像学、肺功能检查基本符合BO 的疾病统一命名为闭塞性细支气管炎综合征（bronchiolitis obliterans syndrome，BOS）[2-3]。BOS 是导致移植后患者非复发死亡的主要原因，其死亡率高达50.0%[4-5]。目前国内外对于BOS的研究多见于成人，儿童鲜见报道，本文通过回顾性分析在本院接受allo-HSCT患儿的病例资料，探究儿童移植后BOS的危险因素及临床预后。

1 对象与方法

1.1 研究对象

回顾性分析2010年10月至2018年12月在苏州大学附属儿童医院接受allo-HSCT患儿的临床资料。纳入标准：①年龄＜18 岁；②移植前肺功能检查基本正常；③allo-HSCT后存活时间＞100天。排除标准：①临床资料不完整；②失访；③allo-HSCT后100天内发生BOS。

本研究获医院医学伦理委员会批准（No.2021CS 143）。

1.2 方法

1.2.1 预处理方案及GVHD 预防 以白消安+环磷酰胺（busulfan+cyclophosphamide，BuCy）为预处理方案的骨架，部分患儿采用氟达拉滨+BuCy，恶性血液病在此基础上加用阿糖胞苷。部分急性淋巴细胞白血病，尤其合并髓外白血病的患儿，以全身照射（TBI）代替Bu。兔抗人胸腺免疫球蛋白（ATG）用于单倍体移植及无关供体移植体内T细胞去除治疗。环孢素（CSA）、他克莫司（tacrolimus，FK-506）或西罗莫司联合吗替麦考酚酯（mycophenolate mofetil，MMF）口服预防GVHD，移植后+1 d、+3 d、+6 d、+11d予甲氨蝶呤口服预防GVHD。

1.2.2 造血干细胞动员和采集 皮下注射重组人粒细胞集落刺激因子动员供者干细胞，剂量每天5～10μg/kg，皮下注射连续4至5天，供者白细胞＞50×109/L后暂停。第4天开始采集外周血干细胞或骨髓干细胞，若第4天干细胞数量不足，第5天继续采集外周血干细胞，然后对采集物进行干细胞常规、单个核细胞（MNC）及CD34+细胞计数检测。

1.2.3 GVHD诊断标准 急性GVHD(aGVHD)和cGVHD的诊断主要参照美国国立卫生研究院（NIH）标准[6]。根据患儿皮疹面积、胆红素水平及腹泻量进行分度，cGVHD主要根据患儿病变范围和严重程度分为局限性和广泛性。局限性：仅有局限性皮肤受累或仅有cGVHD引起的肝功能障碍。广泛性：全身性皮肤受累，或在局限性cGVHD 的基础上合并①肝组织学表现为慢性侵袭性肝炎、桥接性坏死或肝硬化；②眼睛受累，Schirmer 试验湿润度小于5mm；③唇腺活检证明有小唾液腺受累或口腔粘膜受累；④其他任何靶器官的受累。

1.2.4 BOS 诊断标准及治疗反应评估 BOS 诊断标准参考NIH 2005年建立并于2014年修订的诊断标准[7]。BOS分度根据NIH 2014年肺功能及肺部情况评分[7]分为轻度、中度及重度。基于NIH共识[7]，依据FEV1%pred将BOS对治疗的反应分为：①完全缓解（CR），治疗后FEV1%pred≥80%；②部分缓解（PR），初始FEV1%pred＜70%，治疗后FEV1% pred绝对值增加≥10%，但没有达到CR；③病情稳定（SD），初始FEV1%pred＜70%，治疗后FEV1% pred绝对值变化小于10%；④疾病进展（PD），治疗后FEV1%pred 绝对值下降≥10%。

1.2.5 BOS 治疗 本研究29 例BOS 患儿的一线治疗为甲基泼尼松龙，在此基础上增加免疫抑制剂CSA或FK-506，部分患儿口服西罗莫司，同时予小剂量阿奇霉素（5 mg·kg-1·d-1）、孟鲁司特钠及布地奈德雾化治疗，症状改善不明显时加芦可替尼或伊马替尼。此外，8例患儿使用间充质干细胞，4例使用注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白，4 例使用利妥昔单抗，1 例使用吡非尼酮支持治疗。每1～3个月检测肺功能以评估治疗效果。

1.2.6 随访 采用电话随访，随访周期约6个月，随访内容为患儿疾病情况、一般状态、有无严重并发症等，末次随访时间为2019年9月1日，中位随访时间为2.1（1.1～3.5）年。BOS组中位随访时为1.7（1.0～2.9）年，Non-BOS组中位随访时间为2.1（1.1～3.6）年。

1.3 统计学分析

采用SPSS 25.0 进行统计学分析。计量资料符合正态分布的以均数±标准差表示；非正态分布的以中位数M（P25～P75）表示，组间比较采用秩和检验。计数资料以例数（百分比）表示，组间比较采用χ2检验或Fisher精确概率法检验。采用多因素logistic回归分析BOS 发生的危险因素。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，组间比较采用Log-rank 检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

共纳入接受allo-HSCT患儿368例，排除17例，其中10例因临床资料不完整，6例因失访排除，1例100天内发生BOS。最终纳入351例患儿，男213例、女138例，中位年龄75.0（38.0～119.0）月。移植前均无肺部基础疾病。其中急性髓系白血病（AML）97例，急性淋巴细胞白血病（ALL）100例，再生障碍性贫血（AA）64例，骨髓增生异常综合征（MDS）13例，急性混合细胞白血病3例，湿疹血小板减少症伴免疫缺陷（WAS）30例，其他44例。脐血移植105例，骨髓干细胞移植15例，外周血干细胞移植72例，骨髓联合外周干细胞移植159例。所有患儿中29例诊断为BOS（BOS 组），322 例未发生BOS（Non-BOS组），移植至发生BOS的中位时间为10.0（8.5～20.0）月。共发生cGVHD144例，局限性cGVHD85例，广泛性cGVHD 59例。

2.2 BOS预后

截止至2019 年9 月1 日，共29 例诊断为BOS，发生率为8.3%，在cGVHD 患儿中，BOS 发生率为20.1%。在29 例BOS 患儿中，男11 例、女18 例，中位年龄92.0（67.0～132.0）月。因部分患儿年龄小，配合不佳，29例BOS中仅21例完成肺功能检查，肺功能示FEV1占预计值为（51.0±22.3）%，FEV1/FVC为（77.4±22.1）%。余未完成肺功能检查的根据其症状进行评分，BOS组轻度3例，中度10例，重度16例。

351例患儿移植后1、2、3年BOS累积发生率分别为（6.0±1.3）%、（10.0±1.8）%、（10.7±2.0）%；29 例BOS 患儿中，28 例BOS 发病前合并其他靶器官cGVHD；在28 例cGVHD 患儿中，移植后1、2、3 年BOS 累积发生率分别为（12.8±2.9）%、（23.0±4.0）%、（24.4±4.2）%。29例BOS患儿中死亡6例，存活患儿中10例不能脱离吸氧。

2.3 BOS危险因素分析

与Non-BOS 组相比，BOS 组年龄较大，男性比例较低，移植后100 天内有呼吸系统疾病以及合并其他靶器官cGVHD的比例较高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 Non-BOS组与BOS组临床特点比较

将单因素分析P＜0.05 的因素纳入多因素logistic 回归分析，结果显示年龄较大、女性、移植后100 天内有呼吸系统疾病以及合并其他靶器官cGVHD 是BOS 发生的独立危险因素（P＜0.05）。见表2。

表2 多因素logistic回归分析BOS发生危险因素

2.4 BOS组与Non-BOS组预后比较

截止至2019 年9 月1 日，351 例患儿中，死亡41 例，其中Non-BOS 组35 例，BOS 组6 例。BOS组和Non-BOS 组总生存（OS）率分别为71.7%（95%CI：51.7%～91.7%）和87.9%（95%CI：84.0%～91.8%），两组间差异无统计学意义（χ2=2.48，P=0.120）。见图1。16例重度BOS患儿死亡4例，中度死亡2 例，轻度无死亡。中、重度组OS 率分别为（72.0±17.8）%和（70.5±12.6）%，组间差异无统计学意义（χ2=0.09，P=0.812）。29例BOS患儿中，2例出现原发疾病复发，Non-BOS组复发22例，BOS组和Non-BOS组累积复发率分别为（6.9±4.7）%、（8.5±1.8）%，两组差异无统计学意义（χ2=0.00，P=0.948）。

图1 BOS 组与Non-BOS 组总生存率比较

3 讨论

BOS是allo-HSCT后最严重的肺部并发症之一。1982年Roca等[8]首先描述了allo-HSCT后的BOS，它是一种累及小气道的炎性反应，临床主要表现为活动后气促、顽固性咳嗽、喘息，逐渐进展为进行性呼吸困难，很少伴有发热。胸部高分辨CT（HRCT）主要表现为空气潴留、支气管壁增厚、马赛克灌注征和支气管扩张。BOS 的病理特征为肺内终末细支气管内进行性纤维增生，导致气道腔闭塞[9-10]。临床上，BOS 在肺活量测定上表现为固定的气流阻塞，在诊断时，大多数患者表现为中到重度通气障碍，肺功能表现为阻塞性通气功能障碍，而后逐渐发展为混合性通气功能障碍[11-13]。尽管在BOS确诊后进行治疗干预，但BOS患儿通常会出现不可逆转的进行性肺功能下降，5年存活率低至13.0%[14]。本研究对HSCT后BOS患儿的回顾性分析发现，BOS在移植后1、2、3年的累积发生率分别为（6.0±1.3）%、（10.0±1.8）%、（10.7±2.0）%，本研究中29 例BOS 患儿，28 例合并其他靶器官cGVHD，主要影响的靶器官为皮肤、口腔和肝脏，在cGVHD 患儿中，移植后1、2、3 年BOS 累积发生率分别为（12.8±2.9）%、（23.0±4.0）%、（24.4±4.2）%。早期文献估计，在所有接受allo-HSCT 的患者中，BOS 发生率约为2.0%～5.0%，在已经诊断为cGVHD的患者中，BOS发生率为6.0%[15-16]。然而，最近的研究表明BOS发生率有所增加。相关研究发现总体BOS发生率约为5.5%，在存活至少1年的患者中发生率为10.0%，在诊断为cGVHD的患者中发生率为16.0%[17]。也有研究发现BOS在所有移植患者中的总发生率为5.5%，在cGVHD患者中的发生率为14.0%[18]。本研究结果与近期研究基本一致。

许多研究评估了BOS 发生的危险因素，包括除肺部外其他部位的cGVHD、移植后Ⅲ或Ⅳ级aGVHD、外周血干细胞移植、高龄捐赠者、非HLA相合捐赠者、低丙种球蛋白血症和甲氨蝶呤免疫抑制治疗等[19-20]。移植前存在的肺部疾病似乎也是移植后BOS发生的预测因子[21]。此外，呼吸道病毒感染可能会引发BOS患儿的GVHD，供者巨细胞病毒（CMV）和EB 病毒（EBV）血清均阳性也会增加cGVHD的风险[22]。本研究发现，发生BOS前合并其他靶器官cGVHD 和移植后100 天内呼吸系统疾病是BOS发生的独立危险因素，与既往研究结果一致。与之不同的是既往研究BOS 大多发生在接受外周血干细胞移植的患者中，因为外周血干细胞移植更易出现cGVHD，然而本研究发现来源于外周血干细胞的移植方式并未对BOS产生影响，可能与本研究病例数较少有关。而且以往研究很少提及脐血干细胞移植，可能考虑目前针对BOS的研究多集中于成人，成人较少行脐血移植，故无法做回顾性研究。此外，本研究排除了自体造血干细胞移植，考虑BOS主要为cGVHD的一种表现，而自体移植不存在排异反应，但既往也有关于自体移植后发生BOS的个案报道[18-20]，并且出现致死性结局。本研究发现女性及年龄较大儿童受者是BOS 发生的独立危险因素。但通过文献复习未发现有相似结果的报道，其他报道均认为性别并不是影响移植后BOS发生的危险因素，可能与儿童相关研究较少有关，并且本研究是单中心研究，样本数少，可能存在偏倚，仍需多中心研究来验证这一结论。

BOS 的发病机制目前尚未明确，许多研究认为BOS 与cGVHD 有关。目前已提出的机制主要集中于供体T 淋巴细胞、炎症介质和细胞因子。CD 4+辅助T细胞在GVHD的启动和调节中起重要作用。幼稚的CD4+T细胞激活后可以分化为不同功能的T辅助（Th）细胞，包括Th0、Th1、Th2、Th9、Th17和调节性T细胞[23]。肺GVHD发生所必需的T细胞亚群还未完全确定。一般说来，活化的Th1细胞分泌干扰素-γ，而Th2细胞分泌白细胞介素4（IL-4）、IL-5和IL-13，主要通过抗体释放参与体液免疫[24]。越来越多的证据表明，IL-17在aGVHD和cGVHD都起着重要作用[25-26]。也有研究发现，供体细胞中缺乏T-bet转录因子（T-bet在T细胞中表达）促进了Th17细胞的分化和随后的肺纤维化[24]。Flynn[27]等研究数据表明，供体T细胞来源的T滤泡辅助细胞是激活供体骨髓来源的B 细胞所必需的，这些细胞分化为生发中心细胞，导致免疫球蛋白在BOS病变中沉积。

目前多数文献报道BOS发生于移植后100天后，且多数患者在移植后6～12 月发生[28]，本研究中移植至发生BOS 的中位时间为10.0（8.5～20.0）月，与既往报道一致。BOS 起病较为隐匿，临床表现起初多无特异性，主要表现为活动后气促，伴或不伴不同程度的咳嗽、喘息等，本研究中患儿多数以咳嗽为症状，部分以胸闷、经皮动脉血氧饱和度下降为最初表现。HRCT是BOS的重要辅助检查，吸气和呼气HRCT 对阻塞性肺疾病的肺损伤有较好的敏感性。BOS 典型HRCT 的主要表现为空气潴留、支气管壁增厚、马赛克灌注征、支气管扩张，严重时可出现皮下及纵隔气肿等表现[29]。

肺功能检查是临床诊断BOS 的主要手段，本研究仅21 例BOS 患儿完成肺功能检查，FEV1占预计值比值为（51.0±22.3）%，FEV1/FVC 为（77.4±22.1）%，相关研究中发现25例BOS患者在诊断时，FEV1占预计值比值由移植前（88.3±10.9）%降至（42.2±19.0）%，FEV1/FVC由移植前的（88.9±5.6）%降至（58.1±19.5）%[30]。可见FEV1是监测BOS的重要指标，发生BOS时，FEV1会出现迅速下降。但目前也有报道显示早期的小气道病变临床症状多不明显，肺功能常无明显异常改变。有研究发现小气道功能异常与肺部cGVHD相关，提示存在小气道功能损害的患者，可能更容易受到肺cGVHD的影响，小气道功能可能成为预测肺cGVHD的敏感指标[31]。

BOS 为肺部不可逆的表现，病亡率较高。不同文献报道的病亡率也有很大的差异。在不同的研究中，5年存活率从13.0%到56.0%不等[32]。本研究中BOS 组和Nov-BOS 组OS 和累积复发率差异均无统计学意义，究其原因一方面可能与本研究中心BOS组随访时间较短有关，另一方面跟本中心BOS诊疗经验提高，对BOS监测、干预、治疗积极有关。

目前针对BOS的研究主要为回顾性研究，随着BOS发生率的逐年升高，未来对于BOS的研究仍有许多工作要做。BOS的早期诊断对改善BOS预后有显著帮助，有部分前瞻性试验已显示出有效性，目前暂不排除有相关基因多态性与BOS的发生有关，而发现这些基因，有望通过靶向治疗改善预后。