艾叶/茶叶水提物促进皮肤感染模型大鼠创面愈合的协同作用及机制研究

梅瀚文,王笑笑,宗婷婷,苏 航,欧梦喜,王一君,吴生兵

(1.安徽中医药大学针灸推拿学院,安徽 合肥 230012;2.安徽医科大学,安徽 合肥 230032;3.安徽农业大学,安徽 合肥 230036;4.安徽中医药大学针灸经络研究所,安徽 合肥 230012)

皮肤感染是指在正常皮肤屏障功能受损或免疫功能低下的情况下,病原菌侵犯皮肤组织引起的炎症性疾病,临床表现以红、肿、热、痛及皮肤病理改变为主[1-2]。皮肤感染伤口愈合机制复杂,轻者几天内可以痊愈,重者则缠绵难愈,令患者痛苦不堪,甚至会导致全身败血症、脓毒血症,危及患者生命[3-4]。皮肤感染临床上常用抗生素治疗,但近年来病原微生物的不断变迁以及层出不穷的耐药菌株加大了皮肤感染的治疗难度,而且长期使用抗生素会产生一定的不良反应[5-6]。从天然中药中提取药用成分,能够避免耐药性、不良反应等弊端,但单用时往往疗效并不显著[7-8]。诸多研究表明,茶叶、艾叶均有抗菌抗炎、促进创面愈合等功效,可以用于治疗皮肤感染[9-11]。两者能否发挥协同作用增强抗菌抗炎的疗效,是一个值得探讨的问题。本实验尝试将艾叶水提物与茶叶水提物以不同比例混合,探讨两者对皮肤感染模型大鼠的协同治疗作用及其可能机制,现将结果报道如下。

1 材料

1.1 实验动物 70只清洁级SD健康雄性大鼠由安徽医科大学饲养中心[生产许可证号:SCXK(鲁)2019-0003]提供,每只大鼠体质量(200±20)g。在室温环境下用康为IR60独立送风隔离笼具适应性喂养1周,每日定时定量给予大鼠饲料和饮用水,保证笼内温度(22±1)℃,相对湿度55%～60%,1周后大鼠体质量(220±20)g。

1.2 主要试药及仪器 BCA蛋白定量试剂盒:上海赛默飞生物科技有限公司;黑色素瘤缺乏因子(absent in melanoma 2, AIM2)抗体:美国英杰生命技术有限公司;含有CARD的凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD, ASC)抗体:上海钰博生物科技有限公司;Caspase-1:美国CST公司;β-actin:艾博抗上海贸易有限公司;羊抗兔辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记二抗:北京中杉金桥生物技术有限公司;肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)酶联免疫分析试剂盒、上海江莱实业股份有限公司;白细胞介素(interleukin,IL)-1β酶联免疫吸附试剂盒、IL-18酶联免疫检测试剂盒:上海江莱实业股份有限公司;艾叶:南阳市欣研艾草生产有限公司;茶叶:安徽黄大特茶健康产业有限公司;气体麻醉机、异氟烷:深圳市瑞沃德生命科技有限公司;5424R低温高速离心机:艾本德上海国际贸易有限公司;莫匹罗星软膏:湖北人福成田药业有限公司。

2 方法

2.1 模型复制与分组 参照文献[12]复制皮肤感染大鼠模型:用2%异氟烷对大鼠进行吸入麻醉,褪去大鼠背部毛发,用生理盐水清洗,干燥后无菌操作。用手术剪剪成直径约1 cm的圆形皮肤全层切口,深达皮下,以渗血但无明显出血为度。用棉签擦拭伤口部位,随后在每个切口内注入5×108CFU/mL金黄色葡萄球菌0.2 mL,每天1次,连续3 d。随后用无菌敷贴封闭伤口处,使皮肤创口与菌液充分接触。模型复制后48 h切口周围出现红肿,可见黄色脓性分泌物,即表明皮肤感染模型制备成功。模型复制成功后将大鼠单独饲养。实验分为两个部分。第一部分:皮肤感染大鼠模型复制成功后,随机分为模型组、西药组、艾叶水提物组、茶叶水提物组、2∶1组(艾叶水提物与茶叶水提物质量比为2∶1)、1∶1组(艾叶水提物与茶叶水提物质量比为1∶1)和1∶2组(艾叶水提物与茶叶水提物质量比为1∶2),每组7只。第二部分:随机选出7只SD大鼠作为正常组,其余14只进行模型复制,将模型复制成功的大鼠随机分为模型组、2∶1组(艾叶水提物与茶叶水提物质量比为2∶1),每组7只。

2.2 实验药材的制备 参考文献[13-14],利用水蒸气蒸馏法制备艾叶、茶叶水提物。单独艾叶、茶叶水提物制备:分别称取艾叶或茶叶400 g,并加入8倍纯化水,倒入长颈圆底烧瓶中,开始加热,待水沸腾后,打开冷凝管中的流动水。开始收集提取物,萃取4 h后,将收集的提取物静置,取上清液即水提物,分装,分别置于4 ℃冰箱内,密封避光保存。不同比例艾叶/茶叶水提物制备:将艾叶、茶叶按相应比例称质量,以同样的方式加热冷凝收集提取物,后取上清液分装,置于4 ℃冰箱内密封避光保存。

2.3 给药方法 模型组:每天1次清创处理,用生理盐水擦拭伤口,共治疗7 d。西药组:每天1次清创处理,处理后在大鼠创口处涂抹莫匹罗星软膏(3 mL/kg),共治疗7 d。艾叶/茶叶水提物组:每天1次清创处理,处理后在大鼠创口处涂抹艾叶/茶叶水提物,共治疗7 d。

2.4 观察指标及检测方法

2.4.1 大鼠创面愈合情况 观察各组大鼠治疗7 d内创面愈合情况和饮食变化。治疗前先对各组大鼠称质量并测量创口面积,在治疗3 d和7 d后,再次称量大鼠体质量并测量创口面积,拍照做记录。

2.4.2 ELISA法检测大鼠血清AIM2、ASC、Caspase-1及TNF-α、IL-1β、IL-18水平 大鼠治疗结束后次日,对大鼠进行腹腔麻醉。取腹主动脉血约4 mL于采血管中,置于4 ℃冰箱内静置待用。全部采血结束后,将采集的血液平衡放置到高速冷冻离心机中离心,设置时间为15 min、转速为3 000 r/min、温度为-4 ℃。离心结束后,用微量移液枪抽取采血管中1.5 mL淡黄色上清液,置于标号的各组EP管中。参照试剂盒说明书用ELISA法分别检测各组大鼠血清AIM2、ASC、Caspase-1及TNF-α、IL-1β、IL-18水平。

2.4.3 Western blot法检测大鼠皮肤感染创面组织AIM2、ASC、Caspase-1蛋白表达水平 大鼠治疗结束后次日,对大鼠进行腹腔麻醉。在采血完成后,取1.5 cm×1.0 cm大鼠创面皮肤组织,放于各组EP管内,冻存于-80 ℃冰箱内待测。随后分别从每个冻存组织中取100 mg。参照蛋白试剂盒说明书分别检测AIM2、ASC、Caspase-1蛋白表达水平,结果以β-actin为内参半定量进行分析。

3 结果

3.1 第一部分实验结果

3.1.1 各组大鼠治疗前后皮肤感染创面愈合情况比较 模型组创口收缩不明显,创口内仍有脓液,治疗期间体质量持续降低;西药组、艾叶水提物组、茶叶水提物组、2∶1组(艾叶水提物与茶叶水提物质量之比为2∶1)、1∶1组和1∶2组治疗前3 d体质量有所下降,3 d后饮食量增多,体质量有所增长,创口收缩,创面面积明显减小。其中西药组和2∶1组创面愈合效果更明显。见图1。

3.1.2 各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-18水平比较 与模型组比较,西药组、艾叶水提物组、茶叶水提物组、2∶1组、1∶1组和1∶2组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-18水平均显著降低(P<0.05)。与西药组比较,2∶1组大鼠血清TNF-α、IL-1β水平差异无统计学意义(P>0.05),IL-18水平显著升高(P<0.05);艾叶水提物组、茶叶水提物组、1∶1组和1∶2组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-18水平均显著升高(P<0.05)。见图2。

注:A.模型组;B.西药组;C.艾叶水提物组;D.茶叶水提物组;E.2∶1组;F.1∶1组;G.1∶2组;与模型组比较,*P<0.05;与西药组比较,#P<0.05

3.2 第二部分实验结果

3.2.1 各组大鼠创面组织AIM2、ASC、Caspase-1蛋白表达水平比较 与正常组比较,模型组、2∶1组创面组织AIM2、ASC、Caspase-1蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)。与模型组比较,2∶1组创面组织AIM2、ASC、Caspase-1蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。见图3。

注:A.正常组;B.模型组;C.2∶1组;与正常组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05

3.2.2 各组大鼠血清IL-1β、IL-18水平比较 与正常组比较,模型组、2∶1组大鼠血清IL-1β、IL-18水平均显著升高(P<0.05)。与模型组比较,2∶1组大鼠血清IL-1β、IL-18水平均显著降低(P<0.05)。见图4。

注:A.正常组;B.模型组;C.2∶1组;与正常组比较,*P<0.05;与模型组比较,#P<0.05

4 讨论

皮肤感染属中医学“疮疡”范畴,其病因病机多为火热邪毒侵入机体,导致机体免疫力下降,气血运行不畅,经脉闭阻,郁久化热,热盛肉腐积聚成脓[15-16]。艾叶作为灸法的材料,是治疗外科疮疡的常用药材,不仅能提高机体免疫力,还具有清热解毒、祛湿止痒等功效,《本草纲目》记载艾叶可“生肌肉,拓金疮”[17]。茶叶性苦寒,有化痰止咳、清热解毒等功效。《新修本草》言茶叶“主瘘疮”。火热之邪侵入血分,聚于局部,腐蚀血肉则发为疮疡疖肿[18-19]。因此,本研究发挥中医特色,将两者配伍应用,通过药性的相合与制约,选取最优组合,达到整合调节作用。

第一部分实验结果显示,与模型组比较,西药组、艾叶水提物组、茶叶水提物组和3个不同比例组均能促进皮肤感染大鼠创面愈合,并能够降低促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-18的表达水平(P<0.05)。其中以2∶1组和西药组效果更明显,两组促炎因子TNF-α、IL-1β水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。TNF-α、IL-1β、IL-18参与机体的炎症调节和防御反应,对炎症的蔓延和感染扩散具有一定影响[20-22]。本实验结果表明,艾叶水提物和茶叶水提物对促进大鼠皮肤创面愈合,降低炎症反应存在协同作用,其中2∶1组为本次实验最优比例组。

有研究[23]发现,AIM2是可以识别微生物或宿主来源的dsDNA的细胞质传感器,可以感应到多种微生物病原体。在感染发生过程中,当细菌进入细胞质并通过细菌溶解释放细菌DNA,AIM2能够识别病毒或胞内菌等病原微生物来源的DNA,募集接头蛋白ASC和Caspase-1前体,装配形成大分子复合物即AIM2炎症体,介导细胞因子IL-1β和IL-18的分泌和细胞焦亡[24-25]。此外,相关研究[26-27]发现,茶叶和艾叶中有效成分可以通过不同途径抑制AIM2炎症小体的激活。第二部分实验结果表明,模型组大鼠创面组织AIM2、ASC、Caspase-1蛋白表达水平和血清IL-1、IL-18水平明显升高,经涂抹最优比例组药物后,大鼠创面组织AIM2、ASC、Caspase-1蛋白表达水平显著下降,炎症因子表达水平明显减少,证明艾叶水提物和茶叶水提物可以发挥协同作用,抑制AIM2炎症小体相关的炎症反应。

综上所述,艾叶和茶叶治疗皮肤感染存在协同效应,艾叶水提物与茶叶水提物质量比为2∶1是本次实验的最优比例,能够产生最大疗效。两者可以产生协同作用,下调AIM2炎症小体活化和细胞焦亡通路,减缓炎症损伤,防止组织坏死。