三金通淋排石颗粒质量标准的研究*

唐莉华 黄学娣 蒋司晨 李 凡

三金通淋排石汤是院内泌尿外科依据经典名方八正散合岳美中老中医验方三金二石汤,同时结合科室多年临床经验化裁而成[1,2],具有清热利湿、通淋排石、凉血止血之功效,经过长期临床实践应用,其疗效确切、安全性高,已成为院内临床治疗湿热蕴结证之石淋的协定处方。由于该方传统水煎剂质量不稳定,无法满足临床患者的治疗需求,现利用现代化制药技术,对三金通淋排石汤进行颗粒制剂工艺的研究,但仍未建立其制剂相关质量控制标准。为了建立三金通淋排石颗粒的质量标准,本研究参考《中华人民共和国药典》[3]和文献研究[4,5],应用薄层色谱法建立了三金通淋排石颗粒中炒栀子和鸡内金的定性鉴别方法,同时利用高效液相色谱法建立了三金通淋排石颗粒指标性成分栀子苷的含量测定方法,保障中药颗粒制剂质量可控性的同时,提高了临床用药的安全性和有效性,为医院制剂的质量标准提供了实验依据。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪、自动进样器、紫外检测器(Agilent 1260);电子分析天平(FA2204B,济南欧莱博技术有限公司);恒温干燥箱(DHG-9146A,苏州威尔试验用品有限公司);超声波清洗机(SAKEZI-22SX,上海佰博仪器有限公司);硅胶G板(青岛海洋化工,0.20～0.25 mm)、硅胶GF254板(青岛海洋化工,0.20～0.25 mm),聚酰胺薄膜(浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂);甲醇、乙腈为色谱纯,磷酸为分析纯,水为超纯水;栀子苷对照品(批号:110749-201919)、鸡内金对照药材(批号:121153-201002),由中国食品药品检定研究院购入;三金通淋排石颗粒(批号:001、002、003,自制)。

2 方法与结果

2.1 炒栀子中栀子苷的鉴别

2.1.1 供试品溶液的制备取本品5 g,研细后,加50%甲醇50 ml,超声处理40 min,滤过后并蒸干,残渣加水25 ml使之溶解,再用乙酸乙酯振摇并提取3次,每次用量为20 ml,合并提取液后蒸干,残渣加甲醇1 ml溶解,即为供试品溶液。

2.1.2 对照品溶液的制备取栀子苷的对照品,加甲醇制成1 mg/ml的对照品溶液。

2.1.3 缺炒栀子阴性对照品溶液的制备称取缺炒栀子的阴性样品适量,按照“2.1.1”项下同法制成缺炒栀子的阴性对照溶液。

2.1.4 专属性鉴别按照薄层色谱法[3]实验,吸取上述供试品溶液、缺炒栀子阴性对照品溶液各10 μl、对照品溶液8 μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5∶5∶1∶1)为展开剂,展开后取出并晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105 ℃加热至斑点显色清晰,置于日光下检视。从栀子苷色谱图中可以看出,三金通淋排石颗粒样品与栀子苷对照品相应的位置上,均可见相同颜色的斑点,缺炒栀子阴性对照品相应位置上未出现干扰影响,说明该方法专属性良好。见图1。

注:1,2,5.供试品;3.对照品;4.阴性对照品。图1 炒栀子中栀子苷TLC图谱

2.2 鸡内金的鉴别

2.2.1 供试品溶液的制备取本品1.5 g,研细,加乙醇50 ml,加热回流30 min,放冷后过滤,滤液蒸干,残渣加水20 ml,微热使溶解,用三氯甲烷分别提取2次,每次用量为15 ml,合并提取液后蒸干,残渣加甲醇1 ml使之溶解,即为供试品溶液。

2.2.2 对照品溶液的制备取鸡内金的对照药材1 g,按照“2.2.1”项下同法制成对照品的溶液。

2.2.3 缺鸡内金阴性对照品溶液的制备称取缺鸡内金的阴性样品适量,按照“2.2.1”项下同法制成缺鸡内金的阴性对照品溶液。

2.2.4 专属性鉴别按照薄层色谱法[3]实验,吸取上述供试品溶液、缺鸡内金阴性对照品溶液、对照药材溶液各10 μl,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-丙酮-甲酸(10∶4∶1.6)为展开剂,展开后取出并晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105 ℃加热至斑点显色清晰,置于紫外光灯(365 nm)下检视。从鸡内金色谱图中可以看出,三金通淋排石颗粒样品与鸡内金对照药材相应的位置上,均可见相同颜色的荧光斑点,缺鸡内金阴性对照品相应位置上未出现干扰影响,说明该方法专属性良好。见图2。

注:1,2,5.供试品;3.对照品;4.阴性对照品图2 鸡内金TLC图谱

2.3 栀子苷的含量测定

2.3.1 色谱条件色谱柱为Welch C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),以乙腈-水(10∶90)为流动相。流速:1.0 ml/min,柱温:30 ℃,检测波长:238 nm,进样量:10 μl,理论板数按栀子苷峰计应不低于1500。

2.3.2 对照品溶液的制备取栀子苷的对照品适量,精密称定后加入甲醇,制成1 ml含栀子苷60 μg的溶液,即得对照品溶液。

2.3.3 供试品溶液的制备取三金通淋排石颗粒适量,研细后取约1 g,精密称定后加入甲醇50 ml,再精密称定重量,超声处理20 min(功率350 W,频率50 kHz),放冷后称定重量,再使用甲醇补足减少的重量,摇匀后再过滤,留取续滤液,即得供试品溶液。

2.3.4 阴性对照品溶液的制备按照三金通淋排石颗粒处方和工艺制备方法,制成缺炒栀子的样品,再按照“2.3.3”项下同法制备,即得阴性对照品溶液。

2.3.5 专属性试验精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液以及缺炒栀子的阴性对照品溶液各10 μl,按照“2.3.1”项下色谱条件,分别进行测定后记录色谱图。见图3。实验结果可见,栀子苷对照品色谱(图3A)与三金通淋排石颗粒供试品溶液色谱(图3B)在相同保留时间(栀子苷保留时间约在14 min)有对应的色谱峰,峰形良好且与其他各峰分离度高,阴性对照样品色谱(图3C)在相同保留时间(14 min)无对应的色谱峰。表明本实验方法专属性良好,阴性对照品色谱不干扰本实验方法的测定。

图3 栀子苷对照品(A) 三金通淋排石颗粒供试品(B)和缺炒栀子阴性样品(C)

2.3.6 方法学考察线性关系。精密吸取栀子苷对照品溶液(浓度为41.8 μg/ml)1 μl、2 μl、4 μl、6 μl、8 μl和10 μl,按照“2.3.1”项下色谱条件分别进行测定,同时记录峰面积。以栀子苷的进样量(ng)为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y),绘制标准曲线并进行线性回归,得到回归方程为y=1.4339x+22.69,R2=0.9992。实验数据结果表明,栀子苷进样量在130.1～1301.1 ng范围内与峰面积呈良好的线性关系。

精密度。实验精密吸取栀子苷的对照品溶液10 μl,按照“2.3.1”项下色谱条件分别进样6次,同时记录峰面积,计算相对标准偏差(RSD)为0.58%。实验数据结果示仪器精密度良好,能满足三金通淋排石颗粒中栀子苷含量测定的要求。

重复性实验。分别取三金通淋排石颗粒(批号:001)6份,每份约1 g,按照“2.3.3”项下同法制备6份供试品溶液,再按照“2.3.1”项下色谱条件分别进行测定,计算栀子苷平均含量为2.88 mg/g,RSD为0.94%。实验数据结果示,该实验方法的重复性良好。

稳定性实验。称取三金通淋排石颗粒(批号:001)约1 g,按照“2.3.3”项下同法制备供试品溶液,于室温下放置0 h、4 h、8 h、12 h、18 h、24 h以后,分别精密吸取供试品溶液各10 μl,按照“2.3.1”项下色谱条件进行测定,同时记录峰面积,计算RSD为0.73%。实验数据结果示,供试品溶液在室温条件下放置24 h,其稳定性良好。

加样回收率实验。取三金通淋排石颗粒(批号:001,1 g含栀子苷2.88 mg)6份,精密称定0.50 g后置锥形瓶中,分别精密加入栀子苷的对照品溶液1 ml(1 ml含栀子苷1.5555 mg),按照“2.3.3”项下同法,制成加样回收样品溶液,再按照“2.3.1”项下色谱条件分别进行测定,同时记录峰面积,计算加样回收率平均值为98.75%,RSD为0.61%。见表1。实验数据结果示本实验方法准确度良好。

表1 加样回收率实验结果

2.3.7 样品的测定取三金通淋排石颗粒(批号:001、002、003,每批次3份)共9份,每份约1 g,按照“2.3.3”项下同法制备成样品溶液,再按照“2.3.1”项下色谱条件分别进行测定,同时记录峰面积,计算三金通淋排石颗粒中栀子苷的平均含量为2.85 mg/g。见表2。

表2 栀子苷的含量测定结果

3 讨论与分析

三金通淋排石汤为院内长期协定处方,随着临床广泛应用,汤剂的不足之处愈发凸显。中药颗粒剂是传统中药剂型变化的一个新方向,颗粒剂在生产过程和临床应用中,继承了传统汤剂吸收迅速、起效快的特点,又克服了传统汤剂煎煮不便、用量大、易变质等缺点,具有质量稳定、服用方便等优点[6]。其处方组成固定、制备工艺的稳定性,对于中药制剂的质量控制,有着不可或缺的作用。

3.1 定性质量研究中药制剂指标性成分或物质的定性质量研究,主要针对指标性成分或物质的鉴别,薄层色谱法具有操作简单、分析速度快、结果直观显著、成本低廉等特点,并且可同时鉴别多个样品,具有分离和鉴别的双重功能,在中药制剂定性质量控制中有着不可替代的地位[7]。本研究参考《中华人民共和国药典》[3]和文献报道[8],利用薄层色谱法对制剂处方中全部饮片进行鉴别。其中君药金钱草、海金沙,臣药车前子、石韦、萹蓄、瞿麦,佐药川牛膝在分别选择指标性成分和对照药材的情况下,缺阴性样品与供试品色谱专属性不强,阴性存在干扰;在改变样品提取方法和展开条件后,其效果仍不明显,故均未纳入质量标准。同时采用多因素(薄层板、温度、湿度)评价炒栀子和鸡内金的定性鉴别方法,其重现性好,耐用性佳,可纳入三金通淋排石颗粒的定性质量控制。

3.2 定量质量研究中药制剂指标性成分的定量质量研究,主要针对饮片指标性成分的含量测定。高效液相色谱法目前在药品研发、生产、质控、监督等领域有着不可或缺的地位,在药品真伪鉴定、指标性成分含量测定、药品纯度监测等方面,已成为药品检验的主流分析方法[9]。其适应范围广、分析速度快、分离效率高、重现性好等特点,也广泛应用于中药制剂的定量测定[10]。本研究参考《中华人民共和国药典》[3]和文献报道[4,5,11,12],君药金钱草(槲皮素、山柰酚)与臣药车前子(京尼平苷酸、毛蕊花糖苷)的阴性对照均存在干扰,不适宜作为三金通淋排石颗粒指标性成分的定性研究对象,故均未纳入质量标准。由于高效液相色谱法样品取样量少,中药指标性成分的浓度通常较低,为了保证所建立的分析方法的可行性与可靠性,通过方法学(线性关系、精密度实验、稳定性实验、重现性实验、回收率实验等)的验证[13],证明了制剂中栀子苷含量测定的分析方法专属性强、重复性好、稳定性佳、准确度高,可纳入三金通淋排石颗粒的定量质量控制。

3.3 栀子苷含量限度研究《中华人民共和国药典》[3]炒栀子项下规定:水分不得过8.5%,干燥品含栀子苷(C17H24O10)不得少于1.5%。三金通淋排石颗粒每1 g含炒栀子0.15 g,充分考虑大生产环节中的饮片损耗等因素,栀子苷的转移率以60%为标准(制剂工艺研究栀子苷转移率为67%),得出本品每1 g含栀子苷为1.24 mg。故拟将三金通淋排石颗粒含量限度定为: 每克含炒栀子的量,以栀子苷(C17H24O10)计,不得少于1.24 mg。

本研究运用薄层色谱法建立了三金通淋排石颗粒炒栀子和鸡内金的定性鉴别方法,同时运用高效液相色谱法建立了栀子苷的含量测定与含量限度,实验方法操作简便,专属性强,重现性佳,可用于三金通淋排石颗粒定性定量的质量控制。