凉粉草多糖提取、结构及功效机制的研究进展

唐雅园，韦 珍，邓中霖，戴涛涛，梁朋光，孙 健，何雪梅,*

（1.广西壮族自治区农业科学院农产品加工研究所，广西南宁 530007；2.广西果蔬贮藏与加工新技术重点实验室，广西南宁 530007；3.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌 330096；4.烟台黄金职业学院，山东烟台 265401）

凉粉草，素有“仙草”之称，为唇形科凉粉草属一年生草本植物。全世界约有10 种凉粉草属植物，我国主要有两种，分别是凉粉草（Mesona chiensisBenth）和小花凉粉草（Mesona parviflora（Benth）Briq）[1]。凉粉草作为食药同源植物，主要分布在我国两广、闽南、云滇等地区，其中广东增城派潭凉粉草被批准为国家地理标志保护产品。据《中华本草》《全国中草药汇编》《中药大辞典》等书中记载，凉粉草性寒、甘淡凉，具有清热解暑、解热利尿之功效，主治中暑、丹毒、消渴、高血压、关节疼痛等疾病，目前被广泛应用于生产清热解毒类中成药、凉茶、凉粉、功能饮料等[2]。

凉粉草多糖是一种广泛存在于凉粉草的根茎叶各个部位的具有凝胶特性的水溶性多糖，是凉粉草中关键生物活性成分之一，占全草干样的70%[3]，具有抗氧化、降血糖、降血脂、保肝护肝、免疫调节等功能[4]，还有良好的热稳性和促凝性，在食品和制药工业中常被用作增稠剂、稳定剂和凝胶剂[5]，有广阔的开发利用前景。本文结合国内外凉粉草研究现状，系统性介绍凉粉草多糖提取与分离纯化技术，探讨凉粉草多糖的结构与流变凝胶特性，并讨论凉粉草多糖这一功能成分对人类健康的影响，以期为凉粉草高值化加工利用提供借鉴。

1 凉粉草多糖提取与分离纯化

以凉粉草为原料制备凉粉草多糖，需要经过提取、精制、纯化等步骤。提取分离后得到的凉粉草粗多糖中还含有蛋白质、色素等，采用脱蛋白、脱色、除小分子等精制处理。经过精制后的凉粉草多糖，进一步采用离子交换色谱法、凝胶渗透色谱法等方法进行分级纯化，最终得到均一的多糖组分。制备凉粉草多糖的常见方法和流程如图1 所示。

图1 凉粉草多糖提取与分离纯化方法和流程Fig.1 Flow chart and methods of extraction and purification of Mesona polysaccharide

1.1 凉粉草多糖提取

凉粉草多糖的提取方法有传统热水浸提法、热水碱液浸提法、酶辅助浸提法、超声辅助浸提法等。不同提取方法对凉粉草多糖得率和总糖含量有较大影响，影响多糖得率的因素有碱液浓度、提取温度、提取时间、液固比等，得率范围在7.05%～43.84%，具体提取方法及评价见表1。不同品种及不同产地的凉粉草中多糖含量有一定的差异，其中匍匐型凉粉草的多糖含量明显高于直立型[6]，而来自广东饶平和福建漳州的凉粉草的多糖含量较高[7]。此外，同一品种不同部位的多糖含量差异极显著，其中凉粉草叶中多糖含量最高，其次分别为根和茎[8]。不同生长阶段的凉粉草的多糖含量也有着显著差异，特别是在现蕾前期（每年9 月至10 月），全草的多糖积累量达到最高值[9]。

表1 凉粉草多糖提取方法及评价Table 1 Extraction methods for Mesona polysaccharide

1.2 凉粉草多糖纯化

凉粉草多糖的精制与纯化一般包括粗多糖脱蛋白、脱色、除小分子及粗多糖的分级纯化。采用三氟乙酸法、Savage 法、酶法除去凉粉草多糖中的蛋白质。过氧化氢法[15]、活性炭法[25]和树脂吸附法是凉粉草多糖脱色的传统方法。陈荔红等[26]比较活性炭与大孔树脂对凉粉草多糖的脱色效果，确定树脂D301 的脱色效果最佳，多糖脱色率高（超过95%）且损失率低。除小分子等杂质一般采用透析袋透析法。凉粉草多糖分级纯化可采用离子交换色谱法、凝胶渗透色谱法等。采用离子交换树脂（DEAE Sepharose CL-6B、DEAE Sepharose Fast Flow）结合盐梯度将粗多糖的酸性糖组分和中性糖组分分离，凝胶渗透色谱（Sephadex G-75、Sephadex G-100、Sephacryl S-300HR）根据多糖分子量的不同进一步将多糖分离纯化。例如，冯涛等[27]采用DEAE Sepharose Fast Flow 从凉粉草多糖中分离得到一个中性糖组分和两个酸性糖组成。

2 凉粉草多糖结构与流变凝胶特性

2.1 凉粉草多糖结构

凉粉草多糖为杂聚糖，其组成和结构十分复杂，相关研究国内外文献报道较少。多糖的结构分为初级结构（一级结构）和高级结构（二、三、四级结构）。多糖初级结构主要包括多糖分子量、糖基组成及比例、糖基构型、糖苷键类型、糖链中糖基排列顺序、糖链的分支位置与长短等。多糖高级结构主要包括多糖骨架链间以氢键结合而形成的各种聚合体、多糖链间非共价结合形成的聚集体等。由于植物多糖结构复杂、解析难度高、解析技术水平相对有限等原因，目前对凉粉草多糖结构研究主要集中在一级结构解析。

研究多糖结构首先要分析多糖的糖基组成。凉粉草多糖的糖基组成及比例分析常采用薄层层析[28]、还原胺化试剂衍生-液相色谱[15]、酸辅助热水解-离子色谱[7]、柱前衍生-超高效液相色谱-串联四极杆质谱[29]、柱前衍生-高效液相色谱-紫外检测[30]等技术。碱液浸提法制备的凉粉草多糖含有葡萄糖（Glu）、甘露糖（Man）、木糖（Xyl）、鼠李糖（Rha）、半乳糖（Gal）、核糖（Rib）、阿拉伯糖（Ara）、葡萄糖醛酸（GluA）和半乳糖醛酸（GalA），其中多以Glu、Gal 和GalA 为主要糖基成分[30]。

采用离子交换柱、凝胶柱等分离纯化方法从凉粉草多糖中进一步分级分离得到一个中性糖组分（MCP-N）和一个或多个酸性糖组分（MCP-A），其中以MCP-A 为主。进一步通过凝胶色谱、红外光谱、甲基化和GC-MS 分析、核磁共振等现代波谱分析手段确定了凉粉草糖组分的一级结构。多糖提取、分离纯化及结构鉴定方法的差异会导致凉粉草多糖结构表征的差异，具体凉粉草多糖分级纯化及其糖组分特征结构描述见表2。凉粉草MCP-N 和MCP-A 的糖环构型均呈现吡喃型，其中MCP-N 多以β-糖苷键连接，而MCP-A 中同时含有α-和β-糖苷键。

表2 凉粉草多糖分级纯化及其糖组分特征结构Table 2 Characteristic structures of isolated and purified Mesona polysaccharide

此外，通过扫描电镜、X 射线衍射等手段对凉粉草多糖高级结构进行初步探索。董伟等[14]采用扫描电镜分析了碱液浸提法制备的凉粉草多糖的超微结构，观察到多糖表面疏松且有很多密集气孔，呈雪花状，层层叠起，还有很多细小颗粒附在片状物质表面，使多糖呈现较为蓬松质轻的形态。Xiao 等[33]采用X 射线衍射技术分析凉粉草多糖，结果显示，凉粉草多糖具有非晶体结构，且X 衍射曲线呈光束状。

2.2 凉粉草多糖流变凝胶特性

凉粉草多糖具有独特的流变凝胶性质，能在液体状态下呈牛顿流体（低浓度）或假塑性流体（高浓度）。凉粉草多糖的结构特征决定了其流变凝胶特性。与MCP-N 相比，MCP-A 富含GalA，且具有一定的流变特性，而MCP-N 几乎不具有流变特性，推测凉粉草多糖的流变特性差异与其结构中糖醛酸含量密切相关[27]。凉粉草酸性多糖含有α-（1→4）-半乳糖醛酸骨架及α-1,2-鼠李糖残基（图2），推测这一特殊的糖基连接方式使凉粉草多糖具备一定的凝胶特性[31]。

图2 凉粉草酸性多糖的主要结构[31]Fig.2 Main structure of Mesona acidic polysaccharide[31]

另外，已有研究证实，单一的凉粉草多糖溶液的黏度不足以单独形成凝胶。凉粉草多糖需要与小麦[34]、大米[35]、木薯[36]、红薯[37]、玉米[38]、山药[39]等来源的淀粉类成分和大豆[40]、乳清[41]等来源的蛋白类成分相互作用，从而形成具有特殊口感的凝胶。凉粉草多糖与淀粉类、蛋白类成分复配，会改善淀粉、蛋白的结构和功能性质，但是凉粉草多糖与不同淀粉、蛋白的相互作用存在显著差异，且相互作用对凝胶特性（粘性、强度和硬度）、微观形貌以及消化特性均有影响。随着近年来现代分析仪器的应用逐渐普及，多糖分子结构检测分析方法也日趋完善，对凉粉草多糖结构表征与其流变凝胶特性的研究有望进一步深入展开。

3 凉粉草多糖功能活性及其作用机制

3.1 抗氧化活性

降低体内氧化应激水平是当前大健康产业中的研究热点，而凉粉草多糖已被证实是一种天然抗氧化剂。凉粉草多糖具有DPPH、ABTS+、羟基、超氧阴离子等自由基清除能力[42]、Fe2+螯合能力及还原力[43-44]，并表现出稳定的剂量-效应关系。凉粉草多糖可增加小鼠正常肝细胞NCTC-1469 和人体肝细胞LO2 内抗氧化酶活性，降低脂质过氧化物生成，有效防止DNA 的氧化损伤[45-46]。体内模型也证实凉粉草水提取物能增强高血压大鼠、糖尿病大鼠体内的总抗氧化状态[47-48]。此外，李艳萍[49]分析凉粉草生长过程中多糖抗氧化活性的动态变化，发现凉粉草多糖的DPPH 和ABTS+自由基清除能力在现蕾前期（9 月至10 月）达到较高水平，故建议优先采摘9 月至10 月的凉粉草作为抗氧化功能产品的原料。如何提高凉粉草多糖抗氧化活性也是当前极有价值的研究方向。Huang 等[23]采用动态超高压微射流技术辅助处理凉粉草多糖，发现与单一热水碱液浸提法相比，该技术使多糖DPPH 和羟基自由基清除能力分别提高了10.18%和41.03%。

3.2 调节肠道菌群作用

植物多糖对于机体肠道菌群的组成及功能具有重要的影响。肠道菌群的主要作用底物是不完全消化型多糖，这些多糖在不同酶类的消化及肠道菌群的酵解过程中被转化为乙酸、丙酸、丁酸等短链脂肪酸（Short chain fatty acids，SCFAs）及其他代谢产物，进一步发挥调节人体健康的作用[50]。凉粉草多糖可增加免疫抑制小鼠体内的瘤胃菌科（Ruminococcaceae）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）、颤螺菌属（Oscillospira）、布劳特氏菌属（Blautia）以及粪球菌属（Coprococcus）的相对丰度以及抑制拟杆菌科（Bacteroidaceae）和拟杆菌属（Bacteroides）的相对丰度[51]，还能提高小鼠肠道中SCFAs 浓度，促进乙酸、丙酸和丁酸生成[51]，有利于被肠道微生物有效利用，发挥其有益作用。此外，凉粉草多糖可增加溃疡性结肠炎模型小鼠体内的乳酸菌属（Lactobacillus）和粪球菌属（Coprococcus）的相对丰度，抑制螺杆菌属（Helicobacter）和普氏菌属（Prevotella）的相对丰度，修复肠道菌群失调[52]。

3.3 降血糖作用

世界卫生组织和联合国于2016 年已将Ⅱ型糖尿病预防作为健康的首要任务[53]，因此亟待开发预防和治疗糖尿病的功能产品。凉粉草在《中国药植图鉴》和《中药大辞典》中早已有“治疗糖尿病”的记载。冯白茹等[54]以凉粉草为原料研发降血糖制剂，发现该产品对Ⅱ型糖尿病患者有较好的治疗效果，且没有明显的毒副作用。α-葡萄糖苷酶在人体糖代谢过程中发挥着重要作用，凉粉草多糖被证实具有较强的α-葡萄糖苷酶抑制能力，或可被开发成天然α-葡萄糖苷酶抑制剂[55-56]。不同产地的凉粉草提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性各有差异[57]。来自广东饶平产地的凉粉草多糖样品对α-葡萄糖苷酶的抑制效果最佳，IC50值为19.49 μg/mL[7]。凉粉草多糖推测还具有促进葡萄糖氧化分解和糖原合成、抑制糖异生等作用[58]。凉粉草降血糖的功效机制目前尚不明确，有待研究人员的进一步深入研究。

3.4 降血脂作用

血脂异常是心血管疾病的主要危险因素。近年来，食药同源食品的降血脂功效受到广泛的关注，具有辅助降血脂作用的凉粉草具有很大的开发前景[59]。凉粉草多糖通过激活机体丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和腺苷酸活化蛋白激酶（Adenosine 5'-monophosphate（AMP）-activated protein kinase，AMPK）信号通路[60]，改善小鼠的脂蛋白含量和结构（包括降低甘油三酯、胆固醇、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白以及提高高密度脂蛋白），调节脂质运输，进而有效提高脂质代谢能力。此外，凉粉草多糖可降低小鼠的动脉粥样硬化指数，改善血液流变学异常[61]，纠正血脂异常，表明凉粉草可作为动脉粥样硬化的辅助剂。

3.5 保肝护肝作用

肝脏是人体内最重要的代谢和解毒器官[62]，肝脏疾病是一个全球性的健康问题，然而目前用于治疗和预防肝损伤的药物功效作用有限，且副作用多[63]，因此开发有效安全的保肝护肝功能产品迫在眉睫。有研究报道，凉粉草水提取物可抑制大鼠肝纤维化[64]。凉粉草多糖能有效缓解酒精性肝损伤，且呈现出剂量-效应关系，主要是其多糖具有抑制肝脏氧化应激作用，降低肝脏细胞内活性氧水平，局部清除羟基、超氧阴离子等自由基[65]。此外，凉粉草多糖还能改善四氯化碳（CCl4）诱导的和环磷酰胺（Cyclophosphamide，Cy）诱导的急性肝损伤，主要是其多糖有效提高肝脏内抗氧化酶活性，抑制肝脏内促炎因子水平，降低血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶含量[51,66]。通过体内体外肝损伤模型、16S 核糖体RNA（16S rRNA）基因测序、靶向和非靶向代谢组学等现代检测分析手段，系统性阐明凉粉草多糖的保肝护肝机制可能源于其能有效清除自由基并恢复机体抗氧化防御系统，有效控制机体炎症水平，亦或是源于其能有效调节肠道菌群结构，增加有益菌和减少有害菌的相对丰度，影响肠道微生物代谢（包括SCFAs）、花生四烯酸代谢等通路[67]，如图3 所示。可见，凉粉草多糖对天然保肝护肝功能食品的开发具有较高的应用价值。

图3 凉粉草多糖保肝护肝机理示意图Fig.3 Schematic diagram showing the function of Mesona polysaccharide in liver protection

3.6 免疫调节作用

植物多糖的免疫调节作用是其最关键的功能活性之一，常常能通过多条途径、在多个层面对机体免疫系统发挥作用[68]。有研究表明，凉粉草水提取物具有提高机体免疫的作用[69-70]，对小鼠肉瘤S180 有一定的抑制作用，是一种潜在的天然免疫调节剂[71]。黄祥彬等[72]发现凉粉草水提取物能增强小鼠B 淋巴细胞活性，促进溶血素水平，增加抗体产生，进而提高机体的特异性体液免疫功能。进一步有研究确定凉粉草多糖可促进Cy 诱导的免疫抑制小鼠的脾T/B淋巴细胞增殖和脾脏中细胞因子分泌[73]，亦可与刀豆蛋白A 协同促进机体T 淋巴细胞增殖。此外，在机体非特异性免疫应答方面，凉粉草多糖也表现出较强的调控能力。Shen 等[74]发现凉粉草多糖可通过与Toll 样受体4（toll-like receptor 4，TLR4）结合而促进巨噬细胞增殖、吞噬和分泌细胞因子能力，以增强机体免疫应答。Huang 等[75]进一步分析凉粉草多糖作用于巨噬细胞的可能机制是通过上调c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、p38 蛋白激酶、细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）的磷酸化水平而激活MAPK信号通路，进而提高机体非特异性免疫调节能力（图4）。可见，凉粉草多糖能同时促进机体的非特异性免疫和特异性（体液和细胞）免疫功能。

3.7 其他

凉粉草多糖具有抗菌活性，能抑制大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等病原微生物的生长[14]，具有开发成食品防腐剂或保鲜剂的潜在价值。凉粉草多糖还具有一定的抗炎活性，可通过促进抗炎细胞因子分泌、提高肠粘膜屏障功能、抑制TLR4/MAPK/NF-κB 信号通路，进而缓解葡聚糖硫酸钠引起的溃疡性结肠炎[52]。凉粉草水提取物具有抗血压作用，Yeh 等[47]确定凉粉草水提取物可有效抑制自发性高血压大鼠的血压上升。

4 结论与展望

中国凉粉草资源栽培历史悠久，资源丰富且价格低廉，已成为我国南方地区出口创汇的重要农副产品之一。根据加工程度的不同，凉粉草每亩产生的经济效益可使农民收入达4000～10000 元/年。自2010年凉粉草被归为食药同源资源后，近十多年来，国内中药和食品产业对其需求量迅速增加。据不完全统计，目前国内凉粉草每年需求量超过10 万t[76]。王老吉、加多宝、和其正、黄振龙等知名凉茶品牌都以凉粉草全草为主要原料开发加工成凉茶饮品。凉粉草多糖也可作为主要添加物开发加工成黑凉粉、烧仙草、龟苓膏、凉粉草蜜等传统凝胶类凉粉草产品以及冰淇淋[77]、果冻[78]、布丁、酸奶[79]等新型凉粉草产品。在肉制品方面，凉粉草多糖还可作为兼具抗菌、抗氧化以及凝胶特性的外源性物质来改善产品品质、降低生产成本和提高凝胶特性，最终有效延长肉制品货架期[80]。另外，凉粉草多糖与红薯、木薯淀粉或与大豆分离蛋白复配，可制备涂膜剂、可食膜等包装新材料[81-82]。然而作为我国重要的食药同源植物，当前凉粉草高值化加工利用程度仍较低，这极易造成资源浪费。

多糖是凉粉草中最重要、含量最丰富的活性成分，对其进行研究开发具有深远的意义。目前相关研究工作集中于凉粉草多糖提取分离技术优化、流变凝胶特性分析、功能活性评价等，然而对于凉粉草多糖构效关系的研究则尚不明确，关于凉粉草多糖与肠道菌群互作的研究也较少，未来这些研究方向将逐渐成为热点。此外，逐步优化凉粉草多糖提取分离技术，在现有凉粉草产品的基础上开展细胞、动物、临床试验等将有助于凉粉草新功能产品的开发。