帕金森病患者维生素D受体基因多态性及血清25-羟维生素D水平变化观察

李沛珊，夏欢，杨新玲

1 新疆医科大学第二附属医院神经内三科，乌鲁木齐 830054；2 省部共建中亚高发病成因与防治国家重点实验室；3 新疆神经系统疾病研究重点实验室；4 新疆医科大学附属肿瘤医院核医学科；5 新疆医科大学

帕金森病（PD）是一种复杂的进行性神经退行性疾病，以静息性震颤、僵硬、运动缓慢和姿势不稳定为特征。25羟基维生素D［（25（OH）D）］作为维生素D 在外周血的主要循环形式，对于中枢神经系统的保护作用已被证实涉及多个生物学过程，其中包括多巴胺能在神经回路中的传递作用［1］。多项研究［2-3］已提示，维生素D 水平的缺乏与PD 的患病风险增加有关，而该过程首先需要25（OH）D 经过肾脏代谢后与维生素D受体基因（VDR）编码的膜蛋白相结合，然后进一步促进细胞质内一系列的维生素D反应元件（VDREs）的表达，从而发挥促进细胞增殖分化、神经传导、免疫调节和神经可塑性等作用［4］。近年多项荟萃分析均显示，VDR 基因中的单核苷酸多态性（SNPs）与PD易感性有关，尤其是在亚洲人群中VDR基因FokⅠ（rs2228570）和BsmⅠ（rs1544410）两位点的变异可导致PD 的患病风险明显增高［5-7］，但该结果存在一定争议。本研究观察了PD 患者维生素D 受体（VDR）基因多态性及血清25-羟维生素D（25（OH）D）水平变化，分析二者与PD 发病的相关性及对PD 发病的预测效能，以明确VDR 基因多态性及血清25（OH）D水平与PD发病的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2018 年1 月—2022 年12 月在新疆医科大学附属第二医院门诊就诊的PD患者178例（病例组），符合国际运动障碍协会公布的PD最新指南［8］诊断标准。患者男101例，女77例（均为散发性），年龄（61.43 ± 10.46）岁，BMI（22.39 ± 4.22）kg/m2、本科及以上文化程度25 例。排除有外伤性、肿瘤性、药源性、血管性等所致PD患者以及伴有严重器质性疾病及急慢性感染的患者。选取来自相同地区无PD 临床表现及PD 家族史体检健康者185 例作为对照组，男114 例、女71 例，年龄（63.35 ± 11.52）岁，BMI（23.10 ± 5.05）kg/m2，本科及以上文化程度39例。两组上述资料有可比性。该研究均经新疆医科大学第二附属医院伦理委员会认可，受试者均签署知情同意书。

1.2 VDR 基因多态性检测 采用RT-PCR 法。受试者入院时，采用EDTA 抗凝的离心管取空腹静脉血2 mL，采用DNA 提取试剂盒（上海天根生物有限公司）按照说明书的步骤提取外周静脉血DNA。引物由上海生物工程公司合成，FokⅠ位点引物序列：正向为5'-ATTCCAAGCCATGCTCTGAG-3'，反向为5'-TCTTCTCCCTCCCTTTCCAC-3'；BsmⅠ引物序列：正向为5'-GCTGAGGGCCAGCTGGGCAACCTGAA-3'，反向为5'-AACCAGCGGGAAGAGGTCAAGGG-3'。DNA 扩增PCR 总体积为20 μL，PCR 过程如下：94 ℃进行3 min 初始变性，随后变性94 ℃、30 s，位点rs2228570 退火温度68 ℃、1 min，位点rs1544410退火温度62 ℃、30 s，扩增72 ℃、40 s，再扩增72 ℃、3 min，共35 个周期。在ABI 3500 Dx （ABI， San Diego， CA， USA）上进行Sanger测序。

1.3 血清25（OH）D 检测 受试者入院时，采用不加抗凝剂的真空管取空腹静脉血2 mL。将血液标本室温放置30～60 min，2 000×g 离心20 min，制备血清标本后使用SRL 公司的试剂盒（Hachioji， Tokyo，Japan）、ELISA 法检测血清25（OH）D。根据美国内分泌学会临床实践指南［10］：25（OH）D＜20 ng/mL 为缺乏，20～30 ng/mL为不足，≥30 ng/mL为充足。

1.4 统计学方法 采用SPSS23.0 统计软件。采用拟合优度χ2检验计算各位点基因型分布是否符合Hardy-Weinberg 平衡。计量资料比较以±s表示，比较采用t检验或方差分析；计数资料以频次或百分比表示，比较采用χ2检验；采用多因素Logistic 回归分析PD发病独立危险因素。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VDR 基因Fok Ⅰ（rs2228570）和Bsm Ⅰ（rs1544410）位点等位基因、基因型频率比较 PD组、对照组VDR 基因FokⅠ（rs2228570）和BsmⅠ（rs1544410）位点等位基因、基因型频率见表1。PD组与对照组VDR 基因FokⅠ（rs2228570）和BsmⅠ（rs1544410）两位点基因型分布均符合Hardy-Wein⁃berg 检验（P＞0.05）。PD 组FokⅠ位点T 等位基因与TT 基因型频率分别为48.6%、25.3%，对照组分别为37.7%、15.1%，两组比较，χ2分别为8.516、10.383，P分别为0.004、0.001。 PD 组Bsm Ⅰ（rs1544410）位点各等位基因及基因型与对照组比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表1 PD组、对照组VDR基因FokⅠ（rs2228570）和BsmⅠ（rs1544410）位点等位基因、基因型频率

2.2 PD 组与对照组血清25（OH）D 水平比较 PD组血清25（OH）D 水平为（16.06 ± 6.04 ）ng/mL，对照组为（19.22 ± 6.32）ng/mL，两组比较，t=-4.873，P=0.000。

根据VDR 基因的FokⅠ位点基因型分组，PD 组三种基因型TT、TC、CC 患者血清25（OH）D 水平分别为（15.54 ± 6.47）、（16.79 ± 5.76）、（15.31 ±6.08）ng/mL，对照组分别为（18.35 ± 6.50）、（19.74 ±6.26）、（19.04 ± 6.34）ng/mL，两组不同基因型之间比较，F值分别为1.153、0.554，P分别为0.318、0.576。PD 组TC 型、CC 型患者血清25（OH）D 水平均低于对照组（t分别为-3.093、-3.329，P分别为0.002、0.001）。

PD 组血清25（OH）D 缺乏129 例（72.5%），对照组为106 例（57.3%），两组比较，χ2=9.151，P=0.002；PD 组血清25（OH）D 不足44 例（24.7%），对照组为68 例（36.8%），两组比较，χ2=6.162，P=0.013；PD 组血清25（OH）D 充足5 例（2.8%），对照组为11例（5.9%），两组比较，χ2=2.119，P=0.146。

2.3 VDR 基因FokⅠ位点基因型和血清25（OH）D水平与PD 发病的相关性 将是否PD 作为因变量，将VDR 基因FokⅠ位点的基因型及血清25（OH）D水平作为自变量，其中基因型赋值方法（X1，X2），即TT=（1，0），TC=（0，1），TC=（0，0），25（OH）D 赋值方法X3：≤20 ng/mL 即缺乏水平为1，＞20 ng/mL 为0，结果示回归模型为LogitP=－0.939＋0.927X1+0.636X2+0.668X3。血清25（OH）D 水平一致时，基因型TT、TC 分别是基因型CC 患PD 风险的2.527 及1.888 倍（P均＜0.01）。当基因型一致时，血清25（OH）D 水平缺乏是充足水平人群患PD 风险的1.918 倍（P=0.004）。其中，当基因型为TT 且伴25（OH）D缺乏、基因型为TC伴25（OH）D缺乏时，其患PD 的风险分别是基因型为CC 伴25（OH）D 充足人群的4.818、3.822倍（P均＜0.01），结果见表2。

表2 VDR基因FokⅠ位点基因型和血清25（OH）D水平与PD发病关系的多元Logistic回归分析结果

2.4 VDR 基因FokⅠ位点基因型、血清25（OH）D水平对PD 发病的预测效能 VDR 基因FokⅠ位点基因型TT 预测PD 发病的ROC 下AUC 为0.610，95%CI为 0.532～0.687，诊断界值为0.502，灵敏度74.5%，特异度47.4%；血清25（OH）D 水平缺乏预测PD 发病ROC 下AUC 为0.576，95%CI为0.517～0.635，诊断界值为0.466，灵敏度72.5%，特异度42.7%。基因型TT联合25（OH）D 缺乏预测PD 发病ROC 下AUC 为0.693，95%CI为0.588～0.798，灵敏度64.2%，特异度74.5%，均小于75%，ROC 见图1。

图1 不同VDR基因型及血清25（OH）D水平预测PD发病风险的ROC

3 讨论

人类主要通过晒太阳、饮食来补充维生素D，这些补充剂在肝脏中代谢为25（OH）D，后者作为维生素D 的主要存在形式，其水平在不同个体中可能存在较大的差异，这主要取决于季节、居住的纬度、饮食习惯以及其他生活方式等因素［9-10］。在最近一项基于中国人口的维生素D 状况的普查中，维生素D缺乏现象在中国人群中普遍存在，季节变化及省份差异是影响血清25（OH）D 不同水平的重要因素，其中新疆地区人均血清25（OH）D 水平为（18.52 ±8.28）ng/mL［11］。本研究中，PD 组血清25（OH）D 水平不仅仅低于健康对照组，而且也低于上述普查的新疆地区人均水平。一方面，这可能与新疆地区冬季时间较长，人群外出受日照的时间较短有关。另一方面，PD 患者大多以老年患者为主，由于PD 患者特殊的临床表现如运动缓慢和姿势不稳定等，进一步限制了PD患者外出接受紫外线照射的时间，从而一定程度上引起了PD 患者外周血25（OH）D 水平进一步下降。流行病学研究表明，与健康对照组相比，维生素D 水平降低在PD 患者中更为普遍。EVATT等［12］报道了在PD患者基线样本中，分别存在69.4%患者维生素D 缺乏和26.1%不足的高患病率，本研究中PD 组缺乏和不足的百分比分别为72.5%、24.7%，与文献报道一致，这可能与PD 患者长期维生素D 摄入不足有关。一项专注于比利时PD 患者饮食摄入量的研究显示，约超过一半的PD患者存在维生素D 摄入量不足的现象，约62.5%的男性和40%的女性平均每日维生素D摄入量低于10 μg［13］。而在探索维生素D 水平与PD 风险相关性的纵向研究［14］中，研究者发现，在长达29年的随访期间，较高水平的维生素D与较低的PD风险相关，而且血清维生素D 水平充足的个体比缺乏的人群患PD 的风险低65%。在本研究中，缺乏25（OH）D 水平者是充足人群患PD 风险的1.918 倍。另一项研究不仅探索了维生素D水平与PD风险之间的相关性，而且还发现，与健康对照组相比，缺乏维生素D 的个体发生PD的风险不仅明显增高（OR=2.319），而且维生素D缺乏的PD患者低频波动振幅的脑区比其他PD组和对照组范围更广，这表明缺乏维生素D 状态可能对大脑皮层的神经网络功能有一定的影响。维生素D作为一种脂溶性激素，能够穿过血脑屏障作用于中枢神经系统。在中枢神经系统中，维生素D 对细胞增殖、分化、钙信号、神经保护、突触生成、淀粉样蛋白清除和预防神经元死亡具有广泛的作用。在动物模型的相关研究中，维生素D 通过增强酪氨酸羟化酶、多巴胺脱羧酶、多巴胺转运蛋白、脑源性神经营养因子等一系列分子的表达，有效缓解了6-OHDA对多巴胺系统的毒性作用［1，15］。在MPTP 诱导的PD小鼠模型中，维生素D 也可以通过刺激中性鞘磷脂酶活性的途径改善多巴胺细胞轴突的可塑性［16］。在更深入的抗氧化机制研究中，维生素D 被证实可通过改善线粒体功能来保护 PC12 细胞免受氧化应激的损伤，这可能与降低经典NF-κB 通路中Nrf2 表达有关［17］。因此，在未来的研究中有必要从炎症、细胞铁死亡、递质传导等多个信号通路进一步探索维生素D保护多巴胺能神经元的分子机制。

维生素D 向细胞内传递信号是一个复杂的过程。当维生素D 结合到细胞膜上的VDR 时，VDR 形态发生变构后与细胞质中的类维生素受体相互作用形成复合物，后者进一步与大量维生素D 反应元件的靶蛋白相结合，并促进其表达，因此VDR 变异可能导致其功能的进一步变化。近年多项荟萃分析［5，7］发现，VDR 基因多个位点的多态性与PD 风险相关，但是结果存在一定争议。在本研究中，我们发现VDR 基因的FokⅠ位点T 等位基因与中国人群PD 风险增加有关，与国内外大部分的研究［18-19］结果相一致。该机制可能与多态性位点改变VDR 蛋白的功能有关。FokⅠ位点位于VDR 基因的外显子2上，是一种功能性的多态性位点，其多态性可导致不同的翻译起始位点，一个T 等位基因可产生由427个氨基酸组成的较长版本的VDR 蛋白，而另一个C等位基因会导致蛋白翻译起始位点改变，继而产生424个氨基酸组成的较短版本的膜蛋白，导致3个氨基酸在翻译启动前即发生丢失。较短版本的VDR蛋白不仅仅表现出更高的生物学活性，而且在体外研究［20］证实，C 等位基因编码的较短VDR 蛋白质的转录活性比T 等位基因编码的较长版膜蛋白高1.7倍。因此认为，T 等位基因增加PD 的风险可能与较长版本的VDR 蛋白活性降低有关。对于另外一个多态性位点BsmⅠ的研究中，我们并未发现其多态性与PD 的风险有关，该结果与WANG 等［5］的研究相似，这可能与BsmⅠ位于内含子8 的位置有关，虽然BsmⅠ存在A 等位基因至G 等位基因的多态性改变，但内含子并不参与蛋白质的翻译过程，因此，对于BsmⅠ位点与PD 的相关研究有待于后续进一步扩大人群进行分析。

总之，虽然BsmⅠ位点各等位基因及基因型差异与PD 的发生无关，但FokⅠ位点T 等位基因及维生素D缺乏与PD的易感性增高有关，而且当基因型为TT 或TC 且伴25（OH）D 缺乏时，其患PD 的风险将进一步增高，因此，对于存在风险基因型的人群需要临床上更加积极补充维生素D，预防PD发病。