基于GEO数据库相关基因检测数据估算分析直肠癌组织免疫细胞分布变化

王皓，高飞，张怡，葛楠

首都医科大学附属北京中医医院肿瘤科，北京 100010

直肠癌是由多因素参与而形成的疾病，目前手术仍然是惟一根治方法。随着医学的发展，免疫检查点抑制剂在多种实体肿瘤中显示出肯定的效果，但是对于微卫星稳定/无错配修复缺陷的直肠癌患者，免疫疗法获益非常有限。肿瘤微环境（TME）在直肠癌的发生发展中起重要作用，免疫细胞作为肿瘤微环境的重要组成部分，可发挥促瘤作用和抗瘤作用，从而影响肿瘤的进展、预后及免疫药物的治疗效果。所以，研究TME 中的免疫细胞分布情况对于提高直肠癌患者的免疫治疗效果具有重要意义。CIBERSORT 是一种电子计算机方法，用于描述从大量组织样本中获得的高维基因组数据中感兴趣的细胞亚群。CIBERSORT 可以准确地估计肿瘤活检组织的免疫细胞成分［1］。2023 年7—8 月，本研究基于GEO数据库中相关基因检测数据，利用CIBERSORT反卷积算法估算直肠癌组织中免疫细胞比例，分析不同免疫细胞之间以及免疫细胞与患者临床病理特征、预后之间的关系，以期探讨直肠癌组织中免疫细胞分布变化的临床意义，为直肠癌患者的免疫治疗提供新思路。

1 资料与方法

1.1 数据来源及预处理 从GEO 公共数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）检索“人源直肠癌基因”，下载数据集GSE87211（包含多种组织和细胞类型的基因表达数据）。从GSE87211数据集中下载直肠癌组织及直肠正常对照组织（简称对照组织）基因检测数据，这些数据来自203例直肠癌患者的癌组织及其中160 例患者的直肠正常黏膜对照组织（简称对照组织）的基因芯片检测结果。然后将下载的基因检测数据输入到R4.3.2软件中，进行预处理，包括将基因对应多个探针取均值，探针名称转化为标准基因名称，及基因检测数据的校正、标准化处理等。

1.2 直肠癌组织及对照组织中22 种免疫细胞比例估算 在R4.3.2 软件中，根据筛选条件（分析排列次数设置在100次，筛选出P＜0.05的样本。剔除P＞0.05 准确率低的样本）对数据集GSE87211 中的直肠癌组织及对照组织基因检测数据进行筛选，共获得88 个可信的直肠癌组织样本及63 个对照组织样本基因检测数据。应用CIBOSORT 反卷积算法估算上述两种组织样本中22 种免疫细胞亚群（浆细胞、初始B 细胞、记忆性B 细胞、滤泡辅助性T 细胞、调节性T 细胞、γδT 细胞、CD8+T 细胞、初始CD4+T 细胞、未活化CD4 记忆T 细胞、活化CD4 记忆T 细胞、未活化NK 细胞、未活化肥大细胞、活化肥大细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、活化NK 细胞、单核细胞、M0 巨噬细胞、M1 巨噬细胞、M2 巨噬细胞、未活化树突状细胞及活化树突状细胞）的比例。采用R软件中“pheatmap 包”及“vioplot 包”以热图及小提琴图形式呈现免疫细胞比例在直肠癌组织及对照组织之间的差异。

1.3 不同免疫细胞比例直肠癌患者临床病理特征及预后的分析 收集GSE87211 数据集中直肠癌患者的免疫亚型及临床特征数据，比较不同临床病理特征直肠癌患者癌组织免疫细胞比例。

将GSE87211 数据集中肿瘤组织的免疫亚型与临床生存数据进行整合，删除生存时间不明的样本数据，以不同免疫细胞比例的中位值为界，将直肠癌患者分为高比例组和低比例组，对两组患者进行生存分析。

1.4 统计学方法 采用R4.3.2统计软件。计量资料以±s表示，两组间比较采用t检验，3组或3组以上比较采用方差分析、进一步组间比较采用LSD-t检验。计数资料以频次或率表示，比较采用Wilcox检验或Kruskal-Wallis 检验。ggplot2 包绘制主成分分析（PCA）图。采用Pearson 相关性分析不同免疫细胞间的相关性。采用Kaplan-Meier 法进行生存分析，Kaplan-Meier 生存曲线比较采用Log-rank 检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 直肠癌组织和对照组织的免疫细胞比例比较 与对照组织对比，直肠癌组织中M0 巨噬细胞、活化肥大细胞、活化CD4记忆T细胞、中性粒细胞等比例增加，而未活化CD4 记忆T 细胞、记忆性B 细胞、M2巨噬细胞比例减少，见图1。

图1 22种免疫细胞在直肠癌组织及对照组织中免疫细胞亚群比例箱图

直肠癌组织、对照组织中初始CD4+T 细胞比例分别为2.72% 、0.02%，两组比较，P＜0.05。直肠癌组织中活化CD4 记忆T 细胞、调节性T 细胞、未活化NK 细胞、单核细胞、M0 巨噬细胞、未活化树突状细胞、活化肥大细胞、中性粒细胞、记忆性B 细胞、CD8+T 细胞、浆细胞、未活化CD4 记忆T 细胞、滤泡辅助性T 细胞、M2 巨噬细胞、未活化肥大细胞比例分别为7.38%、0.22%、0.18%、1.39%、30.00%、0.13%、12.97%、5.28%、4.34%、2.90%、3.07%、10.43%、0.20%、6.21%、0.85%，对照组织中分别为3.33%、0.02%、0、0.31%、13.20%、0.03%、2.54%、0.02%、12.55%、6.39%、8.07%、19.24%、0.77%、15.34%、6.74%，与对照组织比较，直肠癌组织中初始CD4+T细胞、活化CD4记忆T细胞、调节性T细胞、未活化NK 细胞、单核细胞、M0 巨噬细胞、未活化树突状细胞、活化肥大细胞、中性粒细胞比例高，记忆性B细胞、CD8+T细胞、浆细胞、未活化CD4记忆T细胞、滤泡辅助性T 细胞、M2 巨噬细胞、未活化肥大细胞比例低（P均＜0.05）。主成分分析（PCA）结果表明，浸润性免疫细胞比例可以区分对照组织和直肠癌组织。

2.2 直肠癌组织中不同免疫细胞比例的相关性分析 直肠癌组织中活化肥大细胞和中性粒细胞比例呈正相关（r=0.71，P＜0.05），M2 巨噬细胞和浆细胞细胞比例呈正相关（r=0.65，P＜0.05），CD8+T 细胞和浆细胞比例呈正相关（r=0.62，P＜0.05），中性粒细胞和M2巨噬细胞比例呈负相关（r=-0.62，P＜0.05）。

2.3 不同临床病理特征直肠癌患者癌组织中免疫细胞比例比较 KRAS 突变型的直肠癌患者癌组织中活化CD4 记忆T 细胞、中性粒细胞、调节性T 细胞比例分别为10.29%、6.89%、0.04%，在KRAS 野生型的直肠癌患者癌组织中分别为6.35%、4.76%、0.30%，两组比较，P分别为0.015、0.036、0.015。

有淋巴结转移的直肠癌患者癌组织中浆细胞、γδT细胞、调节性T 细胞比例分别为2.47%、1.15%、0.10%，未发生淋巴结转移的直肠癌患者癌组织中分别为4.14%、2.00%、0.51%。两组比较，P分别为0.032、0.034、0.016。存在远处转移的直肠癌患者癌组织中未活化NK 细胞比例为0.95%、无远处转移的直肠癌患者癌组织中为0.10%，两组比较，P=0.017。

2.4 不同免疫细胞比例的直肠癌患者生存分析结果 浆细胞高比例组患者较浆细胞低比例组患者具有更好的预后（P=0.035），生存曲线见图2。中性粒细胞高比例组患者较中性粒细胞低比例组患者生存期缩短（P=0.033），生存曲线见图3。

图2 浆细胞高比例组与低比例组直肠癌患者的生存曲线

图3 中性粒细胞高比例组与低比例组直肠癌患者的生存曲线

3 讨论

研究证实，直肠癌的发生发展与个体免疫状况有紧密联系。人体的各种免疫细胞相互协同、相互拮抗，维持正常免疫状态。当机体免疫功能低下时，肿瘤细胞持续增殖，导致疾病复发或进展，而肿瘤发生发展可进一步破坏免疫平衡。

NK 细胞是天然淋巴样细胞家族的成员［2］，其杀伤活性无MHC 限制，不依赖抗体，能够在不预激活的情况下快速杀死肿瘤细胞或病毒感染细胞［3］。理论上，NK细胞可以检测到肿瘤的早期迹象并立即做出反应，但事实上，NK 细胞通过释放细胞毒颗粒或通过激活死亡受体方式直接清除癌细胞，这两种杀伤模式都需要在NK 细胞和肿瘤靶细胞之间形成免疫突触。免疫突触的启动、维持和终止是一个严格调控的过程［4-5］。有研究［6］显示，肿瘤细胞过度表达增殖细胞核抗原，导致肿瘤细胞本身可抑制NK 细胞的功能。肿瘤相关基质细胞、肿瘤浸润性免疫抑制细胞可通过细胞间接触或通过释放可溶性因子改变NK 细胞的活性。已知的浸润性肿瘤免疫抑制细胞包括调节性T细胞、肿瘤相关巨噬细胞（TAM）等，这些细胞被证明可通过一系列机制降低NK 细胞的功能［7-8］。其他免疫亚群与NK细胞之间也存在联系。树突状细胞是专业的抗原提呈细胞，NK细胞可以通过促进树突状细胞成熟、消除未成熟和潜在的耐受性树突状细胞来增强T细胞的启动［9］。反过来，树突状细胞也会对NK 细胞存在影响。如IL-15 能促进NK 细胞的存活、增殖和细胞毒活性，是NK 细胞功能的关键调节因子［10］。在小鼠中，树突状细胞可通过反式递呈IL-15 促进NK 细胞产生干扰素-γ 和获得杀伤能力，这一过程被称为“NK预激”［11］。我们研究发现，直肠癌组织中较对照组织未活化的NK 细胞、未活化的树突状细胞升高，表明在肿瘤组织中，浸润的NK 细胞及树突状细胞功能受到抑制，抗原递呈细胞功能的抑制及NK 细胞的沉默可能有助于癌症逃脱免疫监视而促进了肿瘤的进展和转移。所以除了抗瘤免疫细胞在肿瘤床中的浸润外，肿瘤微环境中抗瘤免疫细胞功能的活跃也是成功抗肿瘤的条件之一。

癌症相关的基因可诱导肿瘤抗原的表达，这些抗原可以激活CD8+T细胞。CD8+T细胞可通过表达细胞溶解分子（如穿孔素和颗粒酶），直接杀伤并消除肿瘤细胞［12］。作为抗肿瘤免疫细胞的成员，滤泡辅助T 细胞可促进B 细胞的存活、增殖及分化［13］，同时，还可以分泌多种细胞因子，调控T细胞的功能［14］，所以滤泡辅助T 细胞在体液免疫和细胞免疫中发挥双重作用。有研究显示，随着结直肠癌分期的增加，滤泡辅助T 细胞含量下降，功能失调，造成肿瘤的免疫逃避。我们的研究显示，直肠癌组织中CD8+T 细胞及滤泡辅助T 细胞减少，提示直肠癌患者免疫功能下降。

调节性T细胞是一群通过主动调节的方式抑制自身反应性的T 细胞，从而维持机体免疫耐受的负性调控细胞。免疫耐受的维持机制不仅阻止自身免疫，而且阻碍有效的肿瘤免疫。调节性T 细胞通过高亲和力的IL-2 受体降低肿瘤周围环境中的IL-2，它们还结构性地表达CTLA-4，通过抗原提呈细胞下调CD80/CD86 的表达，从而剥夺了对应答T 细胞的共刺激信号。调节性T细胞还产生免疫抑制细胞因子间接诱导效应T 细胞凋亡、失能或休眠［15-16］，使得肿瘤细胞逃避免疫监视。越来越多的证据表明，在肺、胃肠、胰腺和乳腺癌等多种恶性肿瘤中已经发现调节性T 细胞明显升高，大量调节性T 细胞渗入肿瘤组织往往与预后不良有关。去除调节性T细胞能够激发和增强抗肿瘤免疫反应［17-18］。张帆等［19］研究显示，高调节性T 细胞水平是术后结直肠癌患者复发的独立危险因素，且术后复发结直肠癌患者调节性T 细胞水平要高于未复发的结直肠癌患者，调节性T细胞水平可以作为结直肠癌术后预测复发的指标。本研究结果与既往研究结果一致，直肠癌患者中调节性T 细胞较正常对照高，肿瘤微环境中高表达的调节性T细胞可能促进肿瘤细胞的免疫逃逸。

近年，单核细胞在肿瘤发生发展中的作用逐渐被学者重视。单核细胞可通过调节肿瘤细胞与血管内皮细胞的黏附作用从而在肿瘤转移过程中发挥重要作用［20］。周超等［21］研究显示，当外周血单核细胞计数相对升高时，可能意味着肿瘤负荷以及免疫抑制增加。通过对直肠癌浸润免疫细胞分析，单核细胞在肿瘤组织中较对照组织明显升高，与文献报道结果一致。

癌症中的巨噬细胞是一把双刃剑，具有发挥促肿瘤和抗肿瘤活性的能力，这取决于许多信号的平衡，包括细胞因子、趋化因子等。在大多数类型的肿瘤中，TAM 的高浸润性与预后不良密切相关［22-23］。但在某些肿瘤中，TAM 的浸润也预示着良好的预后［24］。我们研究显示，肿瘤组织M0 巨噬细胞比例较对照组织增加，M2 巨噬细胞比例较对照组织少，可能与肿瘤的异质性和巨噬细胞在肿瘤的分布、激活状态及定位有关。

据研究［25］报道，在癌变过程中，中性粒细胞、肥大细胞等炎症细胞可趋化IL-1、IL-6、IL-8 等细胞因子及血管内皮生长因子导致肿瘤微环境变化，从而促进肿瘤细胞增殖和转移。这些炎症指标的升高与肿瘤预后不良有关。我们的研究结果也显示，在直肠癌组织中，中性粒细胞及活化的肥大细胞比例增高，并且两者呈正相关，反映出在肿瘤发生发展中两者之间的协同作用，而且中性粒细胞高表达的患者预后差。

抗肿瘤免疫细胞和促肿瘤免疫细胞相互对立。我们的研究分析显示，相较于对照组织，促肿瘤免疫细胞在直肠癌中大量招募，一部分抗肿瘤免疫细胞含量减少，而另一部分抗肿瘤免疫细胞也呈现出浸润增加的状态。如肿瘤组织中活化CD4记忆T细胞高表达，提示癌组织中的免疫效应细胞聚集增加，反映了宿主免疫细胞对直肠癌产生了免疫应答反应。CD4 记忆T 细胞经肿瘤抗原刺激后变为活跃的记忆T 细胞，这些肿瘤特异性记忆细胞可以存活并保持有效的免疫监视，具有长期监测和清除残留肿瘤细胞的功能。在乳腺癌、膀胱癌等实体瘤中相关研究证实该细胞亚群的激活与较低的癌症复发有关，预示较好的临床预后。所以，在细胞免疫中，活化CD4记忆T细胞在监视、识别、杀伤肿瘤细胞等起着重要的作用，有助于机体对抗肿瘤和提高预后。另外，我们对免疫细胞亚群比例与临床相关性分析得出，KRAS 突变型的直肠癌患者中性粒细胞及活化CD4记忆T 细胞比例显著增高，这表明直肠癌基因表型的改变可以调控部分免疫细胞，导致促瘤免疫细胞与抗瘤免疫细胞之间对抗的升级。M2 巨噬细胞与浆细胞之间较强的相关性也反映出在直肠癌组织中这两种免疫细胞升级的免疫对抗作用。而在肿瘤晚期，随着肿瘤细胞的转移、病情的进展，促肿瘤免疫细胞的含量升高，而抗肿瘤免疫细胞的比例下降或功能受抑，加剧肿瘤免疫逃逸。

直肠癌中免疫细胞比例的相关性分析显示，促瘤细胞之间、抗瘤细胞之间的正相关及两者之间的负相关表明免疫系统作为一个整体具有高度的一致性。浆细胞由记忆B细胞或B淋巴细胞分化而来，是适应性免疫的主要效应器，可以产生肿瘤抗原特异性的抗体，起到杀伤肿瘤细胞的作用。WOUTERS等［26］通过全面检索PubMed纳入了包括19种癌症共69项研究，结果显示肿瘤浸润性B细胞和浆细胞在大多数癌症类型中发挥着有益的作用，对于预后具有积极的意义，提出潜在的免疫治疗策略包括使用细胞刺激细胞因子或激动剂增强这些细胞的活性。另有证据支持应用特异性B细胞进行过继细胞治疗以达到积极抗肿瘤的目的。我们的研究显示，在直肠癌组织中，具有抗肿瘤的免疫细胞记忆B细胞及浆细胞减少，浆细胞高表达的直肠癌患者生存更长，而且浆细胞与CD8+T细胞呈正相关，具有协同抗肿瘤作用。

综上所述，免疫细胞浸润在直肠癌的发展过程中起着重要作用。我们对直肠癌中22 种免疫细胞进行了研究，分析了不同免疫细胞在直肠癌的浸润情况及相互关系，并找出与预后相关的免疫细胞，相关结果显示直肠癌组织中免疫细胞比例与对照组织相比存在差异，直肠癌不同临床病理特征患者中免疫细胞亚群比例亦有所不同。浆细胞高表达的患者预示着更好的生存结局，中性粒细胞高表达与患者临床预后差有关。本研究为进一步探索直肠癌的微环境及免疫细胞治疗提供一定的参考依据。