儿童脑脊液阳性菌株分布及耐药分析

贾静,郭明发,徐璐,杨俊文,周娟娟,杨俊梅

(郑州大学附属儿童医院/河南省儿童医院/郑州儿童医院 a.检验科;b.血液肿瘤科,河南 郑州 450003)

化脓性脑膜炎是儿童常见的中枢神经系统感染性疾病,脑脊液培养鉴定及药敏是其诊断与治疗的基石[1]。不同病原菌影响患儿临床特征与预后,约1/3的幸存者有不同程度的神经系统后遗症[2]。近年来,多重耐药病原菌检出率在儿科临床逐渐增多[3]。为加强细菌耐药监测管理,获取可靠的耐药数据指导临床经验性抗菌药物的使用,本文回顾性分析脑脊液阳性病原菌分布情况及常用抗生素的耐药性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1菌株来源

收集郑州大学附属儿童医院2017年1月至2021年12月脑脊液培养阳性标本,送检患儿308例,培养阳性菌株共计314株,剔除同一患者分离的重复菌株,其中有6例患儿同时检出2种不同菌株。出院临床诊断显示原发性脑膜炎272例;术后继发性感染36例。脑脊液样本采集后直接注入血培养瓶内送检。严格按照第4版《全国临床检验操作规程》[4]规定和各仪器相关操作说明书进行培养。

1.1.2仪器与试剂

BD血培养仪(儿童需氧、厌氧培养瓶)及凤凰100全自动细菌鉴定/药敏检测系统(Phoenix 100,美国BD公司)、VIKET-2 Compact全自动微生物鉴定药敏仪及其配套药敏卡(法国生物梅里埃公司),MALDI Biotyper系统(德国Bruker公司)及配套的试剂盒靶板购自德国Bruker公司和美国Sigma公司;哥伦比亚琼脂、伊红亚甲蓝琼脂、麦康凯琼脂、Mueller-Hinton琼脂、5%脱纤维羊血MH琼脂、巧克力琼脂、流感嗜血杆菌属药敏培养基加SR0158营养补充剂等实验中所用到的培养基和药敏纸片均为英国OXOID公司产品;青霉素、万古霉素和美罗培南E-test试纸条为郑州安图生物工程有限公司产品;革兰染色液(快速法)、抗酸染色液(冷染法)、墨汁荚膜染色液为珠海贝索生物技术有限公司产品;同时以肺炎链球菌ATCC49619、金黄色葡萄球菌ATCC25923、金黄色葡萄球菌ATCC29213、粪肠球菌ATCC29212、流感嗜血菌ATCC49247、大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853作为质控对照菌株。

1.2 方法

1.2.1脑脊液涂片检查

所有收集临床样本直接进行墨汁染色、革兰染色、抗酸染色检查。染色过程严格按照产品说明书中相关操作说明进行。

1.2.2分离培养

将脑脊液注入儿童需氧、厌氧培养瓶,放入血培养仪中培养,待仪器报警后将标本转种在血平皿、巧克力平皿,置35 ℃ 5%CO2孵箱中培养过夜,18～24 h后观察结果,孵育后取纯菌进行仪器鉴定。

1.2.3细菌鉴定及药敏试验

收集菌株采用Phoenix 100和MALDI Biotyper系统进行细菌鉴定,鉴定到种。革兰阴性杆菌和革兰阳性球菌主要应用VITEK-2 Compact和Phoenix 100全自动微生物鉴定仪进行药敏试验。嗜血杆菌采用纸片扩散法,链球菌除青霉素、美罗培南及头孢曲松应用E-test试纸条(药敏结果按照脑脊液药敏试验进行判读),其余药敏仍可自动化分析(Phoenix 100鉴定系统);所有药敏结果参照美国临床实验室标准化协会[5]推荐的药敏试验方法及折点标准进行判读。

1.2.4统计学方法

采用WHONET 5.6软件对2017—2021年数据进行回顾性耐药分析,菌种分布、耐药率以及细菌敏感率采用百分率表示;应用SPSS 21.0软件对不同分组之间耐药率进行比较,组间比较采用χ2检验,多组间两两比较采用Bonferroni法校正,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 涂片结果

革兰染色检出阳性球菌8例,直接墨汁荚膜染色2例,抗酸染色阳性0例。

2.2 脑脊液病原菌分布情况

314株病原菌中革兰阳性菌204株(65.0%),革兰阴性菌106株(33.8%),真菌4株(1.3%)。具体分布见表1。

表1 脑脊液常见病原菌年份分布[n(%)]

脑脊液检出菌,以二、三季度检出为主,占62.4%,见图1;年龄分布显示婴儿组46.8%最多,其次新生儿组24.8%。见表2。

2017年第一季度脑脊液分离菌株“0”。

表2 脑脊液分离菌患儿年龄分布[n(%)]

2.3 革兰阳性菌药敏分析

314株病原菌其中葡萄球菌属未发现万古霉素、利奈唑胺耐药菌株;肺炎链球菌对青霉素耐药检出16株(占88.9%),未发现万古霉素耐药菌株。见表3。

表3 主要革兰阳性菌常用抗生素耐药分析[n(%)]

2.4 革兰阴性菌药敏分析

314株分离菌革兰阴性菌以大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌为主,常用抗生素耐药率见表4。

表4 主要革兰阴性菌常用抗生素耐药率分析[n(%)]

本研究分离314株菌株,其中多重耐药菌149株,各年龄组之间、性别之间、年份之间多重耐药发生率差异无统计学意义(P>0.05)。不同科室之间多重耐药的发生率存在差异,外科监护室的多重耐药率最高,但与早产儿科、神经外科、新生儿内科、内科监护室的多重耐药发生率差异无统计学意义,神经内科多重耐药发生率低于外科监护室与神经外科(P<0.05)。见表5。

表5 2017—2021年多重耐药菌株流行病学分析(n,%)

3 讨论

化脓性脑膜炎起病急,治疗困难。世界卫生组织研究显示,脑膜炎每年在全世界造成25万人死亡,其中大多数涉及儿童[6]。国内儿童脑膜炎的发病率为(6.95～22.30)/10万,由于抗菌药物的过度使用,病原菌的耐药性是一个全球性公共卫生问题[7-8],不同国家地区、不同年代以及不同年龄段脑脊液病原菌分离可能有所差异。

本研究收集脑脊液病原菌314株,主要以凝固酶阴性葡萄球菌为主,其占比为29.3%(92/314),这与北京儿童医院报道[9]一致。孙鑫晔等[10]研究显示脑脊液培养出的凝固酶阴性葡萄球菌80%属于污染,因此临床在判断脑脊液感染时要根据患儿临床症状及其他结果综合判断。此次收集病例经查询出院临床诊断均提示化脓性脑膜炎感染,其中诊断原发性脑膜炎272例,术后继发性脑膜炎36例;脑脊液直接涂片阳性检出率较低可能与脑脊液采集标本量较少有关。本研究显示儿童脑膜炎二、三季度更常见,年龄主要集中在婴儿与新生儿期,患儿主要来自神经外科和新生儿内科,提示要重视低年龄患儿脑脊液培养,外科手术后应注意术后护理,避免术后感染[11]。本研究中发现链球菌感染引起的儿童化脓性脑膜炎与2012年之前有所增加,检出肺炎链球菌18株、无乳链球菌8株。肺炎链球菌引起的化脓性脑膜炎属于侵袭性脑膜炎,常发生于儿童等免疫力低下的人群中。2017年我国引进了针对肺炎链球菌的13价肺炎链球菌结合疫苗,但被列为Ⅱ类疫苗,并未强制注射[12],提高此种疫苗的覆盖率可能对降低肺炎链球菌的感染率有帮助。单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes,Lm)引起的化脓性脑膜炎目前国内报道较少,它主要引起早产儿、新生儿脑膜炎,一般由母体传播,重症预后差。本研究显示脑脊液每年都有Lm的检出,Lm引起的化脓性脑膜炎应受重视,对于早产儿、新生儿患儿要了解其母亲健康状况,及早作出诊断,提高重症患儿治愈率。314株脑脊液病原菌革兰阴性菌以大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌为主,占10.2%(32/314)、6.7%(21/314),这与赵静丽等[13]研究一致,而成人化脓性脑膜炎革兰阴性菌以鲍曼不动杆菌感染最常见[11],提示儿童化脓性脑膜炎革兰阴性菌感染与成人可能有一定的差异性。

本次研究药敏结果显示,多重耐药菌占47.5%(149/314),年龄主要分布在1岁以内患儿,但耐药率在不同年龄组、不同性别、不同年份之间差异无统计学意义,不同科室之间多重耐药率的差异可能与患儿类型有关。耐药菌株中检出MRCNS,占46.3%(69/149),MRSA检出3株,MRSA检出率低于MRCNS,未发现对万古霉素、利奈唑胺耐药的葡萄球菌,因此这些药物仍然是治疗葡萄球菌感染的有效手段[11]。其中利奈唑胺是新型恶唑烷酮类抗菌药物,具有组织穿透性强、脑脊液浓度高等特点,为临床治疗耐药及难治性葡萄球菌所致的儿童化脓性脑膜炎提供了新的选择[14]。肺炎链球菌对红霉素、克林霉素耐药率达100%,可能因儿科常经验应用大环内酯类抗生素,致使红霉素耐药率较高;青霉素耐药率达88.9%,青霉素显然已经不是肺炎链球菌脑膜炎的首选药物[15],药敏结果显示头孢噻肟敏感性较高。革兰阴性菌中大肠埃希菌对美罗培南和亚胺培南耐药率为3.2%,但对三代头孢类抗生素耐药率较高,检出ESBLs菌18株,这可能与临床经验应用三代头孢类抗生素有关。药敏研究发现大肠埃希菌对阿米卡星全敏感,但阿米卡星对于儿童副作用较多,可引起耳毒性、肾毒性,限制其临床应用。肺炎克雷伯菌检出CRE 17株,陈玥等[16]研究中提到成人碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(carbapenem resistantKlebsiellapneumoniae,CRKP)脑膜炎可选药物有限且疗程较长;国内报道主要采用以替加环素为基础的联合用药方案,朱钱迎等[17]研究中提到替加环素在药物通透性及抗菌活性方面极佳,从而有效清除CRKP,用药过程中细菌不易发生耐药情况,而替加环素是儿童禁用药,所以儿童CRKP的产生增加了临床治疗难度。美国传染病学会推荐CRKP脑膜炎的治疗,静脉用药可以选择高剂量美罗培南、多黏菌素B或E[18]。因此,儿童CRKP脑膜炎时临床医生可考虑联合用药替代单一用药。研究显示编码碳青霉烯酶的基因绝大部分位于质粒或其他可转移的遗传元件上,使其能在同种或不同菌种间水平传播,引起院内感染的爆发流行[19],所以对于多重耐药菌株感染患儿要加强管理,及时隔离治疗,避免发生院内感染。

4 结论

脑脊液感染患儿年龄主要集中在1岁以内,引起感染的革兰阴性菌以大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌为主,且ESBLS及CRE菌株较常见,因此要重视脑脊液病原菌的分离培养,关注耐药菌株的流行趋势,为临床经验治疗提供依据。本研究为单中心研究,也存在不足之处,未考虑环境、地域因素,学龄前组与学龄组纳入研究对象相对较少,是否能全面反映不同年龄组以及不同科室之间分离菌株特点尚需更大样本量验证。