显微共焦拉曼光谱仪的使用与维护

高维亚，赵春海，窦守席

（1.滨州市检验检测中心，山东滨州 256600； 2.滨州职业学院生物工程学院，山东滨州 256600）

拉曼光谱分析技术是在20 世纪20 年代逐步发展起来的一项技术，是基于印度物理学家拉曼所发现的拉曼散射效应，对与入射光频率不同的散射光谱进行分析，得到分子振动或转动方面信息，并应用于物质分子结构研究的一种分析方法。拉曼光谱作为一种可以对物质结构和成分进行“指纹”识别的光谱技术，具有无损、信息丰富、无需样品制备等优点，使得拉曼光谱成为探测样品信息的有力工具。目前，拉曼光谱技术已发展成为一项非常成熟的技术，已成为分析检测领域[1-5]中的重要分析手段之一。传统的检测手段多集中在色谱法和色谱-串联质谱法等，由于存在样品预处理步骤复杂、费时耗力等缺点，在快速测定和实时监测方面存在一定局限性。拉曼光谱技术因其自身操作简便，以及高灵敏度等特点，近年来已成为生物[6-8]、制药[9-10]、材料[11-12]、地质[13-14]、环境监测[15]、半导体[16]、反恐[17]和珠宝鉴定[18-19]等众多分析领域的重要研究方法。显微共焦拉曼光谱技术是将拉曼光谱技术和显微分析技术结合起来的一种应用技术，显微共焦拉曼光谱仪将拉曼光谱仪和光学显微镜耦合在一起，通过不同倍数物镜观察样品的形貌特征，并通过共焦针孔实现空间滤波功能，将激光光斑聚焦在样品上进行拉曼测量。聚焦良好的激光束能够给出很小的激光斑点，从而获得较高的横向空间分辨率，同时激光束的快速发散还能够获得较高的轴向(深度)分辨率[20]，因此显微共焦拉曼光谱技术具有高灵敏度和高分辨率的优点，是目前最适合用于物质微观结构检测的拉曼光谱技术。

InVia Reflex 显微共焦拉曼光谱仪是英国雷尼绍(Renishaw)公司生产的由一台研究级显微镜和一台高性能拉曼光谱仪耦合而成的具有快速、高灵敏度、高空间分辨率和高度自动化的拉曼光谱分析仪器，是研究级显微拉曼光谱仪。该仪器具备以下特点：(1)高度自动化，易于操作和维护，全自动化功能可实现操纵激光波长、滤光片和光栅的变化；(2)性能出众，实现高信号传输效率与高光谱分辨率和稳定性相结合；(3)高灵活性和可升级性，可配用附件、激光器、光纤探头或将拉曼与其它技术(SEM、AFM、TEM 等)联用；(4)功能强大，进行拉曼和光致发光两种测量，以获取材料在电子和振动结构方面的信息，可生成高质量、细节丰富的拉曼成像。

笔者以InVia Reflex显微共焦拉曼光谱仪为例，结合笔者的使用及管理经验，对其工作原理、使用方法、管理与维护进行了总结，并着重对仪器使用过程中的常见问题与解决方案进行了分析，以期为拉曼光谱研究及相关工作提供帮助。

1 工作原理

InVia Reflex 显微共焦拉曼光谱仪系统结构如图1所示，主要由激光器、激光光路、信号光路、光探测器、数据读取系统及电脑控制系统组成。该仪器工作原理是基于拉曼散射的产生和分析，通过激光光束的聚焦、拉曼散射的产生、光谱分析和显微观察等步骤实现对样品的分析。在拉曼光谱检测中，散射光的频率和强度与样品的分子结构、组成和性质有关，不同化学结构化合物分子的拉曼位移不同，被称为化合物分子指纹光谱。通过对拉曼光谱的峰位、峰形、强度等参数进行分析，可以获得样品的化学成分、结构等信息，也可对降解、聚合物反应等过程进行原位监测。通过精密控制光学平台按一定步长进行移动，对样品进行全面快速扫描，利用光谱数据分析软件对采集到的光谱数据进行处理，得到高分辨率的拉曼成像。

图1 InVia Reflex显微共焦拉曼光谱仪系统结构Fig.1 System structure of InVia Reflex microscopic confocal Raman spectrometer

2 仪器的使用方法及样品处理

2.1 开关机与校准

InVia Reflex 显微共焦拉曼光谱仪的测试过程一般包括开机、校准、放置样品、聚焦样品、设置检测参数、光谱采集、数据保存。

显微共焦拉曼光谱仪的校准关系到样品测试数据的准确性。仪器状态会受到环境温度和湿度、激光器和光栅的切换等因素影响，使仪器的灵敏度和准确度出现偏差，因此有必要在测试前对仪器进行校准。校准方式主要有两种：内置硅片校准和外置硅片校准。InVia Reflex 显微共焦拉曼光谱仪自带内置硅片校准，可在仪器开机后，通过操作WIRE软件，系统将自动切换至内置硅片进行自动峰位校正。

图2 为使用仪器内置单晶硅校准后的结果，室温条件下单晶硅的峰位于520.7 cm-1处。

图2 单晶硅的一阶拉曼光谱图Fig.2 First order Raman spectrogram of monocrystalline silicon

2.2 样品预处理

拉曼光谱可以用来分析固体、粉末、液体、气体、胶体、软膏等多种不同类型的样品，所测样品须为具有共价键或分子间作用力的物质，并非所有的分子结构都有拉曼活性。检测拉曼光谱时一般不需要制备样品，特别是带有显微镜的激光拉曼光谱仪。

(1) 固体样品。通常的块状固体材料样品，不管其体积和大小如何，只要将样品固定在拉曼光谱仪的样品台上进行测试即可。如果样品体积较大，需要使用光纤探针，直接在原位置对样品进行测试，应尽量选择表面平整的区域。对于粉末样品，测试前应先用载玻片将粉末样品压平，以获得平整表面。进行拉曼成像时，要求成像区域水平且平整，不平整的样品可以借助美工刀刮平。

(2) 液体样品。对于不易挥发的液体样品，可将其倒入一个小的培养皿中，或者用滴管吸取适量滴在载玻片上，然后放置在拉曼光谱仪的样品台上进行检测。对于易挥发或具有腐蚀性的液体样品，可先将其倒入一个无色透明的玻璃瓶中，盖好瓶盖，或者将其封闭在细毛细管中，然后放置在拉曼光谱仪的样品台上进行检测。激光被直接聚焦在样品上或者透过容器壁聚焦于样品上。

(3) 气体样品。气体样品一般置于密封的玻璃管或者细毛细管中，气体样品的拉曼散射强度通常较弱，一般在测试前需对其进行压缩处理，以增大气体密度，测试时选用大功率激光器，增大激光功率，获得高质量拉曼光谱。

3 仪器的管理与维护

3.1 仪器维护

显微共焦拉曼光谱仪是一种精密仪器，需要定期进行清洁维护保养，以确保仪器正常运行和精准度，提高仪器的使用效率并降低故障率。显微共焦拉曼光谱仪的维护工作需由专人负责，主要内容包括工作环境的维护和仪器设备本身的维护，即(1)定期清洁仪器外壳和显微镜镜头；(2)在不使用时，需存放在室温、干燥、无尘的环境中，因为温度过高或过低、湿度过重、灰尘积累都可能会影响光谱仪的使用精度；(3)定期检查仪器各个部件，如激光器、CCD探测器等是否正常工作，如果发现问题需要及时修理或更换；(4)避免在同一天多次开关机，尽量保持开机状态，待实验结束后关机，以提高激光器的有效使用寿命。定期对仪器进行维护可以有效预防事故的发生，延长仪器的使用寿命。

3.2 管理人员的培训

大型仪器设备的高效运行，是提高科技创新能力的重要支撑，是高校、科研及检验检测机构必不可少的物质基础。保证仪器设备的有效运行，可以提高仪器设备的使用效益、科研效益和经济效益。InVia Reflex 显微共焦拉曼光谱仪属于大型分析仪器，仪器比较昂贵，应实行专人管理负责制。仪器管理员负责设备的操作和日常维护。仪器管理员在使用设备之前应接受仪器公司的工程师培训，学习仪器的使用方法、流程、注意事项及维护方法。仪器管理人员应定期检查设备的运行情况，做好维护管理工作，保证仪器正常有序运行。

4 测试过程常见问题及解决方案

4.1 激光器使用的安全问题

在设备使用过程中，需要特别注意的是激光器使用时的安全问题。高功率激光会对人体组织产生严重伤害。InVia Reflex 显微共焦拉曼光谱仪安全防护分为三级：Class 1，Class 3B和Class 4。若设备配有显微镜遮光罩，安全级别将达到最高级Class 1，无须担心激光辐射。若无任何保护，会存在潜在激光暴露危险，建议使用多套安全眼镜或护目镜，避免激光对眼睛的直接伤害。

4.2 选择激光器

拉曼光谱分析系统最早使用的光源是太阳光和汞灯。激光器出现后，因其具有亮度极高、方向性强、单色性和相干性能好、几乎是线偏振、传输距离长等优点，迅速成为最常用的激发光源，对拉曼光谱技术的快速发展起到了至关重要的作用。在日常检测中，可通过选择不同波长的激光器避免样品被烧坏，获得高质量的拉曼光谱信号。不同波长激光器的应用领域及优缺点见表1[20]。

表1 不同波长激光器的应用领域及优缺点Tab.1 Application fields and advantages and disadvantages of lasers with different wavelengths

4.3 光谱中的假峰

假峰主要有以下几种形式：宇宙射线、光源发射线(等离子线等)、外界干扰光源发射线(显示器屏幕、室内荧光灯等)和常见气体来源(N2、O2)。实验室内的白光照明灯可能会发射一定波长的谱线，在拉曼测试过程中被检测到，在相同位置重复出现，尤其在使用长焦物镜时更明显，此时可以考虑关闭照明灯，在暗室测试。如果仪器配备显微镜遮光罩，则照明灯影响较小。

宇宙射线的产生是宇宙中的高能粒子轰击CCD 探测器而产生电子，被CCD 检测为信号所致。宇宙射线一般具有两个特点，一是随机产生，位置不固定，可用重复测试的方法判断是否为宇宙射线，若消失或出现在其它位置则为宇宙射线；二是强度高，峰宽较窄，仅占几个波数。图3 中框出的峰为宇宙射线。当出现宇宙射线时，可以使用配套软件中的去宇宙射线功能将其去除。

图3 宇宙射线拉曼光谱图Fig.3 Raman spectrogram of cosmic ray

4.4 激光损坏样品

在进行样品测试时，激光照射在样品表面的能量较大，尤其是一些对热或光十分敏感的样品，非常容易被激光灼烧，导致测量信号包含样品被烧毁后的特征，而不是样品本征的信号(例如非晶碳膜在1500 cm-1附近的本征峰在强光激发时会显示出石墨化的碳峰)，因此必须足够重视激光对样品可能引起的损伤。当遇到样品被激光损坏时，可在测试前后通过显微镜白光像，观察样品表面是否发生明显变化，观察出峰位置及峰形是否发生变化，然后选择合适的激光功率来进行测试。

为避免样品表面烧毁，在开始测试时应选用较低的激发功率。在保证样品不被烧毁的前提下可提高激发功率以得到比较强的信号。当激光功率衰减到1%仍无法避免样品烧毁时，可考虑更换激发光、转换低倍物镜或者以散焦方式照射样品，以降低照射在样品表面的功率密度。图4为样品被激光灼烧后的白光图[21]。

图4 激光损坏样品白光图Fig.4 White light image of laser damaged sample

4.5 荧光背景过强

荧光是一种光致发光现象，普遍存在于拉曼光谱采集过程中，拉曼光和荧光都是在激光激发下产生的，可有效消除荧光干扰，获得准确、可靠的拉曼谱图，是进行拉曼光谱采集的关键。部分物质的拉曼光谱荧光背景较强，可通过适当方式抑制或消除荧光干扰。图5为典型的荧光背景较强的拉曼谱图［21］。

图5 荧光背景较强的拉曼光谱图Fig.5 Raman spectrogram with strong fluorescence background

4.5.1 内源性方法

内源性方法通过以下两种途径抑制或消除荧光干扰：(1)降低样品温度，如利用液氮、液氦降低温度；(2)加入荧光猝灭剂浸泡，如加入硝基苯、KBr，AgI等。该方法常在生物类样品测试中采用。

4.5.2 外源性方法

外源性方法通过以下几种途径抑制或消除荧光干扰：(1)荧光具有固定的波长范围，可以通过切换不同波长的激光，避开背景荧光干扰；(2)改变激光功率，使拉曼信号和荧光信号的相对强度改变；(3)选择高共聚焦模式，减小样品测试体积元，以减少样品衬底材料荧光对表面材料的干扰；(4)通过强激光长时间照射漂白，持续照射样品1 min以上，利用物质的“荧光漂白效应”消除荧光干扰。例如，通过测试发现，蚕丝是一种典型的具有“荧光漂白效应”的物质，图6 为蚕丝样品经激光照射不同时间后的拉曼光谱变化。由图6 可以看出，随着激光照射时间增加，荧光效应得到了有效抑制。王国祯等也发表了类似研究结果[22]。

图6 激光照射不同时间后蚕丝样品的拉曼光谱图（黑色：激光照射10 s；红色：激光照射20 s；绿色：激光照射30 s；蓝色：激光照射40 s）Fig.6 Raman spectrogram of silk samples after laser irradiation for different times（Black： Laser irradiation for 10 seconds； Red： Laser irradiation for 20 seconds； Green： Laser irradiation for 30 seconds；Blue： Laser irradiation for 40 seconds）

4.6 光谱信噪比差

信噪比(SNR，Signal to Noise Ratio)，是指接收到的有用信号的强度与接收到的干扰信号(噪声和干扰)的强度的比值。在拉曼光谱实验中，得到一张信噪比高、高质量的拉曼光谱图非常关键。提高信噪比可以减少噪声对信号的干扰，从而提高信号的质量和可靠性，高质量的拉曼谱图能够体现出精细的信息。可以通过以下几种方式增加信噪比：(1)增加激光功率；(2)增加曝光时间；(3)增加累积次数；(4)更换高倍物镜。

4.7 光谱信号过强

采集拉曼光谱时，有时会得到光谱信号过强的谱图，即饱和拉曼光谱图，如图7所示。这是因为激光功率过大造成的拉曼响应过大，谱线变成虚点形状，谱线的饱和溢出部分被拉到0。当遇到光谱信号过强时，将激光功率调低、减小曝光时间即可。

图7 饱和拉曼光谱图Fig.7 Saturated Raman spectrogram

4.8 拉曼光谱图因样品位置取向不同而不同

拉曼光谱图因样品位置取向不同而不同是由入射激光照射在样品表面不同晶面取向上引起的，可采用四分之一波片对激光进行扰偏去除方向效应。

4.9 金属拉曼光谱

有研究报道，密排六方晶格结构(HCP)金属(如Be、Re、Os等)在特殊条件下存在拉曼活性。常见的金属(如Fe、Cu、Au 等)在常温常压下大多为体心立方或面心立方结构，没有拉曼活性模，不会产生拉曼光谱信号。然而，在HCP 金属的晶格中，一个原胞单元由两个原子组成，具有拉曼活性[23]。金属的拉曼光谱可以提供关于金属表面和内部结构、振动模式以及电子结构等信息，这些信息对于了解金属的物理和化学性质以及在高压等极端条件下的行为具有重要的意义。1992 年，Olijnyk[24]首次测得高压下金属Ge在50 GPa的拉曼光谱。Novoselov等[25]用拉曼光谱研究了铪在室温下0～67 GPa压力区光谱的演变。刘静仪等[26]测量了金属元素锇(Os)、铼(Re)的高压拉曼光谱，发现Os在高压下存在电子拓扑跃迁的光谱学证据。

5 结语

显微共焦拉曼光谱仪作为一种重要的分析仪器，广泛应用于基础研究、应用研发、产品质量检测等领域。目前国内在拉曼光谱研究领域发展良好，部分团队研究水平及成果已位于世界领先地位。了解显微共焦拉曼光谱仪的工作原理、使用方法、管理与维护、常见问题及解决方案，对于提高仪器的使用及管理水平，进一步促进拉曼技术的应用具有重要意义。