类器官在儿童遗传性疾病中的应用研究进展

雷敏，蔡春泉

类器官是干细胞在体外3D 培养条件下进行扩增并定向分化形成的多细胞团，具有类似其来源组织的生理结构和功能特点，同时具有自我组织和更新能力［1］。目前，类器官已在模拟正常生理模型、疾病病理模型、药物筛选及再生医学等方面展现出巨大的优势。类器官技术经历了十余年的发展，尤其自2015年以来，类器官专利数目呈指数性增长。类器官技术的出现，为儿童遗传性疾病的研究开辟了新的道路。但现有类器官培养体系仍然存在一些局限性，如何摆脱局限，优化方案，实现标准化构建及评价，并将其应用于遗传性疾病的研究和临床应用中，仍需大量的实践与探索。本文将围绕类器官技术，着重介绍其在儿童遗传性疾病中的应用，并对其面临的挑战和未来发展趋势予以展望。

1 类器官简介

类器官是指将成体干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞（iPSCs）以及肿瘤组织细胞接种于基底膜提取物或基质胶中，再经过特定细胞因子复合物作用，形成的高度保留来源组织器官特性的3D球状复合物模型［1］。在既往生物医学研究中，模拟人体生理发育及疾病病理的模型主要是2D 细胞模型和动物模型，尽管它们一直广泛应用于临床研究中，但细胞系的来源单一、缺乏信号转导因子；动物模型培养周期长、效率低、成本高。因此，这两种模型不能完全满足生物医学研究的需要［2］。类器官培养周期短、效率高，能更加准确地反映生理发育和疾病病理状态。目前，类器官已广泛应用于人体生理发育和疾病模型的模拟、药物筛选及个性化治疗等方面［3］。

Sato等［4］将成体肠道干细胞包埋在基质胶中，首次形成了3D培养的肠道类器官，目前已经有很多类型的特异性类器官被培育出来。在生理模型中，肝脏、大脑及肠道类器官占据前3 位；在疾病模型中，肿瘤模型占总数的76.30%［5］。此外，类器官可优选应用于药物筛选，揭示了类器官技术在精准医疗和临床前药物筛选中的巨大商业价值［5］。

2 类器官在儿童遗传性疾病中的应用

2.1 作为疾病的模型 类器官与来源的组织器官保持高度的相似性，可以极好地平衡建模时间与成本，可用于模拟儿童遗传性疾病。类器官模型的获取通常采用两种方法：（1）通过患者的活检组织建立类器官。（2）在野生型类器官中引入特异的基因变异。第2种方法极大地受益于成簇规则间隔短回文重复序列/相关蛋白9（CRISPR/Cas9）技术的出现，该技术可以靶向切割被特定RNA引导识别的基因座。由于一些基因变异在发育早期即可致命，从而很难获得该类患者的活检组织，因而将类器官和CRISPR/Cas9 技术结合作为一种研究基因变异的方法，具有里程碑式的意义［6］。

2.1.1 作为囊性纤维化（cystic fibrosis，CF）的研究模型 CF 是一种常染色体隐性遗传疾病，由CFTR基因变异引起，主要累及患者的消化系统。CFTR蛋白功能障碍可导致液体运输和黏液形成异常，从而累及多个系统［7］。Dekkers 等［8］首次使用CF 患者的直肠类器官模型进行了毛喉素诱导肿胀试验（forskolin induced swelling test，FIS），定量分析了CFTR功能读数并描述了CFTR调节剂在肠类器官中的作用机制，FIS开始用于测试携带不同CFTR变异的患者形成类器官的药物反应。Bijvelds 等［9］成功培养了CF 的肠道及胆道类器官模型，并通过FIS证实了两种类器官模型在不同药物作用下转运碳酸氢盐和氯离子的区别。CF同样易累及呼吸系统，患者肺部分泌大量黏液，为病原体提供了良好的繁殖环境，最终可导致呼吸衰竭。CF的气道类器官可以从患者来源的iPSCs 获得。Rodenburg 等［10］通过CF患者的鼻腔气道上皮细胞形成类器官模型，同时利用CRISPR/Cas9技术进行TMEM16A基因敲除，用于研究TMEM16A和CFTR在呼吸道上皮细胞中的调节机制。Hirai等［11］利用基因编辑技术，形成了携带delF508纯合变异以及携带delF508和G551D杂合复合变异的肺类器官模型，并评估了不同变异模型对CFTR调节剂的反应。因此，气道上皮类器官可结合基因编辑技术形成携带不同CFTR突变的类器官模型，同时为CF药物开发提供平台。

2.1.2 作为神经系统遗传病的研究模型 人脑类器官首次由Lancaster 等［12］开发，用于模拟胚胎时期大脑的组织结构和发育轨迹，脑类器官可发育出各种离散但相互依赖的大脑区域。脑类器官的出现为研究神经系统遗传病提供了机会，一些基因突变利用类器官技术已被确定可导致遗传性小头畸形，如WDR62基因［13］、CPAP基因［14］、AUTS2基因［15］等。An等［14］使用CRISPR/Cas9 技术形成携带编码中心体CPAP-E1235V变异的大脑类器官模型，用于研究中心体功能障碍导致的常染色体隐性遗传性小头畸形，弥补了中心体基因突变小鼠模型在模拟疾病上的缺陷；结果表明，CPAP-E1235V 突变体干扰了参与中心粒延伸的几种中心粒蛋白，引发神经元过早分化并诱导p53 依赖性神经元死亡。Fair 等［15］成功构建了携带AUTS2基因错义变异的大脑类器官模型，发现其与正常大脑类器官相比，表现出生长受损以及神经祖细胞增殖缺陷、极性消失的现象，同时利用基因编辑技术纠正变异，达到对生长受损及神经祖细胞增殖缺陷的挽救效果，该研究阐明了AUTS2基因变异在先天性脑畸形中的病理生理机制。此外，还有LIS1基因变异导致的无脑回畸形［16］，RAB39b基因变异导致的大头畸形［17］。

2.1.3 作为消化系统遗传病的研究模型 Bigorgne等［18］成功构建了携带TTC7A变异的肠道类器官，用于多发性肠道闭锁的研究。该研究发现TTC7A变异可以导致Rho 激酶活性增加，破坏肠上皮细胞的极性，从而引发多发性肠道闭锁，为了解多发性肠道闭锁的机制及其与RhoA信号通路的关系提供了见解。在一项针对先天性肠上皮疾病—微绒毛包涵体病的研究中，Duclaux-Loras 等［19］通过CRISPR/Cas9 技术生成了UNC45A缺陷的Caco-2 细胞，随后将野生型和突变型UNC45A基因分别导入Caco-2细胞中形成类器官模型进行互补实验，以研究UNC45A缺陷与微绒毛包涵体病表型之间的关系，结果表明，UNC45A缺陷型类器官表现出顶端运输受损、微绒毛形成异常以及转运蛋白定位错误，进而引发腹泻、胆汁淤积等症状。在一项针对Alagille 综合征的研究中，Guan 等［20］利用iPSCs 成功构建携带不同JAG1变异的肝脏类器官，发现JAG1变异中的C829X会损害类器官的发育，而G274D不会影响类器官发育，证明了JAG1基因的不同变异类型可能对Alagille 综合征的发展产生影响。综上，类器官模型的建立与基因编辑技术的结合为深入研究儿童的各种遗传病的发病机制及开发新的治疗方法提供了重要见解。

2.2 用于遗传缺陷的矫正 通过人体分离的干细胞进行体外扩增形成的类器官可以保持基因组稳定性，利用CRISPR/Cas9技术，可以从患有某种遗传性单基因疾病的患者中分离出类器官，并对类器官进行基因组编辑以纠正变异，CRISPR/Cas9 技术和类器官的结合使得再生医学治疗具有了理论支持。

Schwank 等［21］利用CRISPR/Cas9 基因组编辑系统，对培养的2 例CF 患者肠道干细胞进行同源重组，以矫正CF 变异，首次从原理上证明了类器官进行基因组编辑可纠正遗传缺陷。Geurts等［22］建立了1 个包含664 例CF 患者的直肠类器官生物库，同时利用基于CRISPR 的腺嘌呤碱基编辑技术成功修复了4个选定样品的无义突变，证明了CRISPR技术在基因矫正中的潜力。

视网膜色素变性是一种不可逆的遗传性视网膜病变，由于其遗传异质性和复杂的发病机制，目前仍无法治愈。RPGR基因变异是导致该疾病最常见的原因。Deng 等［23］从3例RPGR基因变异的患者身上获得了iPSCs，将其分化衍生为视网膜类器官后，利用CRISPR/Cas9技术纠正RPGR变异，使得部分光感受器结构和电生理特性得到恢复，逆转纤毛病变，在培养皿中实现了RPGR变异的靶向基因治疗。

Zhao 等［24］使用患者iPSCs 衍生的人类心脏类器官对家族性心肌病进行研究，发现携带E848G变异的心脏类器官的收缩功能显著降低，而对舒张功能的影响很小；最后使用CRISPR/Cas9 技术与心脏类器官相结合以纠正E848G致病变异，成功改善了心肌收缩功能。

通过基因组工程在人类类器官中矫正遗传缺陷的成功案例仍然很少，仍需不断地探索和优化。传统的CRISPR/Cas9基因组编辑技术利用Cas9核酸酶与RNA结合后靶向诱导双链DNA断裂，通过同源定向修复实现基因矫正，但这种类型的矫正往往是低效的。研究人员开发了一类新的腺嘌呤碱基编辑器，可以在基因组DNA中将A·T碱基对转化为G·C碱基对，扩大了碱基编辑的范围；这些碱基编辑器无需双链DNA断裂或提供供体DNA模板，使其成为更有效、更精确的基因组编辑方法，进一步扩大该技术安全性和实用性；随着对基因组编辑技术的进一步研究，将为未来遗传性疾病的矫正提供更多可能［25］。

2.3 用于遗传性疾病的个性化治疗 传统的细胞系模型与3D类器官模型存在着明显的基因差异，使用传统的细胞系模型可能会忽略一些关键的靶点，类器官与来源的组织器官保持高度的相似性，可以极好地平衡建模时间与成本。使用类器官模型有助于发现新的药物靶点。Amarachintha 等［26］在胆道闭锁患儿的组织中培养出胆道类器官，通过激活成纤维细胞生长因子-2和表皮生长因子途径，可以逆转许多缺陷，改善极性，降低类器官的渗透性，最终开发出一种可以抑制纤维化并避免肝脏移植的治疗方法。Kaji等［27］利用体外构建的MY05B敲除空肠类器官对微绒毛包涵体病进行研究，发现MYO5B缺失会影响Wnt/Notch 信号通路的平衡以及影响小肠中的祖细胞分化，Notch抑制剂苯二氮改善了肠上皮细胞的分泌和细胞分化，可能是微绒毛包涵体病的潜在治疗方法。SERPINA1基因变异可导致A1AT 蛋白错误折叠并在肝细胞内积累，致肝脏损伤，使用抑瘤素M 可以使肝脏类器官上SERPINA1的表达增加，从而为A1AT缺乏症的治疗提供了可能［28］。

通过类器官技术已经发现了很多CF 的潜在治疗靶点。Ramalho 等［29］对97 例CF 患者的肠道类器官进行了FIS，结果表明FIS有助于对CF患者的严重程度进行分类，CFTR功能读数可用于指导CF 患者的个性化治疗。CFTR调节剂疗法显著提高了患者的生活质量，降低了病死率。类器官能够以个性化的方式进行CF 疾病分类、开发药物和优化治疗［30］。Hirai 等［11］发现在CF 患者的肺类器官中SGLT1 的表达水平较高，并测试了SGLT1/2 靶向药物对类器官模型的影响，表明SGLTs可能是治疗CF的潜在治疗靶点。Rodenburg 等［10］使用TMEM16A基因敲除技术，证明了TMEM16A和CFTR在呼吸道上皮细胞中可能具有不同的调节机制，同时对CF患者的鼻腔气道上皮类器官进行了中等通量的药物筛选，它们可诱导不依赖于CFTR和TMEM16A的上皮细胞液分泌，可能为CFTR调节剂无效的患者提供替代疗法。类器官为CF患者提供了药物筛选模型，尤其是针对氯离子转运体TMEM16A的药物，已被证明为CF 患者的可替代治疗方法。

类器官不仅可用于研究不同突变类型的遗传性疾病，还可以通过培养不同疾病阶段的类器官来持续评估治疗效果以及个体耐药性。利用药物开发、细胞治疗、免疫治疗、基因校正或几种治疗方法的组合达到个性化治疗的目的。

3 类器官在遗传性疾病中的前景

虽然类器官在医学研究中具有诸多优势，但也存在一些局限性，如培养体系的不稳定导致类器官产生的可重复性和统一性差；复现来源器官动态微环境的能力有限；营养物质交换受限于被动运输而出现中心细胞坏死现象；培养过程中无法进行高通量分析、手工操作繁琐等［31］。目前科研工作者正努力尝试通过调整培养基和基质胶、细胞因子、培养方法及体系等来建立更加高效可靠的类器官模型。

3.1 类器官芯片技术 类器官芯片作为一种新兴前沿交叉技术，利用医学与现代工程技术交叉融合极大地弥补了类器官在应用上的局限性，不仅具有类器官重现组织结构和功能上的优势，还实现了利用微流控在微米尺度上操控流体以及生物传感器对参数变化的动态捕捉，进一步提高了对实验参数变化的灵敏度以及生物模型的仿真度［2］。

目前已有类器官芯片模型用于遗传性疾病的研究。Hiratsuka等［32］开发了常染色体隐性遗传性多囊肾病的类器官芯片模型，以动态研究疾病病理学并确定潜在的治疗靶点。研究人员使用3D 打印的微流控芯片将PKHD1变异类器官置于流体环境中，通过机械应力激活RAC1 和FOS 的表达，诱导远端肾单位形成囊肿，并利用患者肾脏样本的类器官芯片模型测试了靶向RAC1 和FOS 的药物，发现它们抑制了囊肿的形成。Li等［33］使用类器官芯片模型探讨了多囊肾病代谢、线粒体功能以及囊肿发生机制。发现流体剪切应力可以影响葡萄糖代谢进而促进类器官中的囊肿扩张，通过达格列净等药物可以调节葡萄糖代谢从而抑制囊肿生长。目前类器官芯片仍处于探索阶段，有着广阔的发展前景。

3.2 高通量筛选 研发药物需要考虑药物的临床不良反应和药代动力学等，但因为临床模型的缺乏使得药物研发过程变得成本高且周期长［34］。分子生物学时代的到来使得现代药物研发模式逐渐过渡到靶向药物的高通量筛选，药物研发领域也由此展现出巨大的发展前景。目前已有自动进行干细胞分离培养类器官并进行药敏试验的一体化机器成功应用于类器官药物筛选。Renner等［35］将自动化中脑类器官工作流与人工智能相结合用于帕金森病的高通量筛查分析，人工智能可以充分利用庞大的数据库，并关联跨学科的结果驱动数据分析，为创建下一代3D神经疾病的模型奠定了基础。Tran等［36］开发出一种改良的肾脏类器官平台，可以有效地生成数千个肾脏类器官小单位，经转录组分析和免疫荧光验证发现该肾类器官与人体肾脏有极高相似性，随后通过灭活PKD1和PKD2基因形成了常染色体显性多囊肾病的囊肿模型，因此该平台可用于肾脏遗传性疾病的建模；同时，该平台制定了一个小分子筛选流程鉴定潜在的治疗常染色体显性多囊肾病的小分子化合物，利用图像分析系统对类器官进行实时分析，并评估药物对类器官生长和囊肿形成的影响，因此该平台为肾脏遗传性疾病进行高通量药物筛选提供了更经济高效的途径。

4 小结与展望

类器官的发展为医学研究提供了新的技术手段，可用于构建各种遗传性疾病模型，帮助临床医生深入了解病理机制及潜在的治疗策略。尽管类器官技术发展十分迅速，但未来类器官领域的主要的挑战将是尽可能弥补与天然器官之间的差距，这就要求类器官模型在可复性、成熟度及培养结构上有所提升。利用测序技术及RNA 断层扫描技术有助于提高类器官培养的可复性，利用生物反应器及激光消融、生物打印法构建血管化有利于提高类器官培养的成熟度，开发新的类器官相容性材料或与特定组织结构相匹配的干细胞培养支架可用于改善类器官结构，克服这些挑战需要多学科尤其是与生物工程学领域的交流合作。目前，类器官技术仍存在一些缺陷，如未能完全复原细胞微环境、存在培养条件的优化问题以及类器官库的规范化建设等问题，但随着技术本身及配套技术的进展，未来类器官模型的应用可能会彻底改变昂贵漫长的药物研发过程，提高个体治疗的精准性，并更广泛地应用于遗传性疾病的治疗中。