甘肃地区遗传代谢病疾病谱及致病基因分析

张钏 惠玲 周秉博 郑雷 王玉佩 郝胜菊 达振强 马莹 郭金仙 曹宗富 马旭

（1.甘肃省妇幼保健院/甘肃省中心医院/甘肃省缺省缺陷与罕见病临床医学研究中心，甘肃兰州 730050；2.国家卫生健康委科学技术研究所/国家人类遗传资源中心，北京 100081）

遗传代谢病（inherited metabolic disorder,IMD）作为出生缺陷重要组成部分，是由于编码物质代谢所必需的酶或辅酶基因变异引起相应功能蛋白活性降低或丧失，导致机体代谢紊乱的一组疾病［1-2］，目前已报道的IMD 有1 450 多种［3］。新生儿IMD 筛查可及时对IMD 患儿进行早期诊断和及时干预，对改善预后十分重要［4］，具有重大社会效益［5-6］。

对IMD 患儿进行基因分型意义重大，明确基因分型后可以精准地指导后续治疗、遗传咨询及婚育问题。IMD 的疾病谱及患病率存在地域性差异［7］。甘肃地处我国西北地区，医务人员整体对遗传病尤其是IMD 的认识非常有限，许多IMD 的患病率没有数据，以及治疗规范没有建立。临床上经常出现IMD 患儿因不能及时得到诊断造成干预治疗不及时的严重后果。截至目前，尚未见甘肃地区IMD疾病谱及患病率的相关研究报道。

本研究进行了甘肃地区IMD 疾病谱及致病基因研究，以期实现对本地区IMD 患儿的早期诊断和及时干预，改善预后，为本地区建立精准的IMD筛查、诊断、预防体系提供基础性数据与策略。

1 资料与方法

1.1 研究对象

回顾性收集2018 年1 月—2021 年12 月甘肃省妇幼保健院286 682 例新生儿IMD 筛查的串联质谱数据，受检者按人口基数比例来自甘肃省的12 个地级市、2 个自治州的23 个县，占2018—2021 甘肃省出生人口的26.42%（108.5万）。

本研究获得家属知情同意并签署知情同意书，并通过甘肃省妇幼保健院伦理委员会审查［（2021）GSFY伦审65号］。

1.2 基因组DNA提取

采集患儿及其父母外周静脉血2～3 mL，EDTA抗凝。应用北京天根生化科技有限公司生产的血液基因组DNA 提取试剂盒（货号：DP348）提取基因组DNA。

1.3 高通量测序分析

采用全外显子组测序技术（北京智因东方转化医学研究中心）进行检测，目标区域20×以上，覆盖度达95%。检测区域包括外显子区和剪接区、部分内含子区；可检测变异类型包括非重复区域的单碱基变异、小片段插入/缺失（≤20 bp），以及部分外显子缺失/重复和拷贝数变异。

1.4 数据分析

高通量测序结果与参考基因组（GRCh37/hg19）比对得到所有变异的SNP_INDEL 文件，对检测到的碱基改变进行筛选，最后依据美国医学遗传学与基因组学学会（American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG）指南［8］判读新变异的致病性。

1.5 Sanger测序验证

基因外显子扩增引物由上海生工生物工程股份有限公司完成。PCR 扩增体系为25 μL：2×Taq PCR Mastermix（北京天根生化科技有限公司）12.5 μL，基因组DNA模板1.5 μL（浓度20～50 ng/μL），上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，ddH2O 10 μL。PCR 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，对单一目的条带的产物采用PCR 产物纯化试剂盒（北京天根生化科技有限公司）纯化后，由ABI 3500 型（ABI，美国）测序仪进行测序，使用SeqMan 软件与标准序列对测序结果进行比对分析。

1.6 IMD诊断

根据《新生儿疾病串联质谱筛查技术专家共识》［9］，基于本实验室建立的特定疾病的关键生物标志物的检测值及临界值，根据串联质谱检测结果，结合基因分型及患儿临床表现综合确定IMD种类。IMD种类的确定由实验室数据分析人员与临床医生共同决定。

2 结果

2.1 新生儿IMD分布

286 682 例新生儿经基因检测明确诊断IMD 180 例，包含28 个致病基因导致的23 种IMD，总患病率为0.63‰（1/1 593）。苯丙酮尿症（phenylketonuria,PKU）患病率最高，为0.32‰（1/3 083）；其次是甲基丙二酸血症（methylmalonic acidemia,MMA）（0.11‰，1/8 959）、四氢生物蝶呤缺乏症（tetrahydrobiopterin deficiency,BH4D）（0.06‰，1/15 927）、希特林蛋白缺乏症（0.02‰，1/47 780）。本地区前11 种IMD（患儿数≥2）的累计患病率达93.3%。见表1。

表1 甘肃地区286 682例新生儿IMD疾病谱

2.2 IMD遗传方式分布

23 种IMD 中，21 种（91%）为常染色体隐性遗传，肉碱软脂酰转移酶2缺乏症为常染色体显性遗传，鸟氨酸氨基甲酰转移酶缺乏症为X连锁隐性遗传，见表1。180 例患儿中，177 例（98.3%）致病变异均来自父母；1例致病变异来自母亲和自发变异；2 例为自发变异（X 连锁隐性遗传和常染色体显性遗传患儿）。

2.3 新变异及其致病性分析

28 个致病基因中，共发现166 种变异，其中9个基因的13种变异为ClinVar（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/）和HGMD（https://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php）数据库未报道的新变异。根据ACMG 指南，5 种新变异为致病变异，7 种为可能致病变异，1种为临床意义未明。见表2。

表2 甘肃地区IMD致病基因新变异位点及致病性分析

3 讨论

新生儿IMD 筛查目标是预防或降低IMD 病死率，对社会和儿童个人都是有益的［9-10］。新生儿IMD筛查并不具有诊断性，结果异常时应进行基因诊断，对新生儿进行精准评估，有利于早期干预治疗，可有效降低包括脂肪酸氧化缺陷、尿素循环障碍等在内疾病的患病率和病死率［5，10-13］。

IMD 疾病谱及患病率在全国存在地域性差异。河南地区IMD 总患病率为0.48‰（1/2 085），其中患病率最高的为MMA，其次为高苯丙氨酸血症（hyperphenylalaninemia,HPA）、原发性肉碱缺乏症（primary carnitine deficiency,PCD）、3-甲基巴豆酰辅酶A 羧化酶缺乏症（3-methylcrotonyl-coenzyme a carboxylase deficiency,MCCD）、短链酰基辅酶A 脱氢酶缺乏症（short-chain acyl-coenzyme a dehydrogenase deficiency,SCADD）、希特林蛋白缺乏症、戊二酸血症Ⅰ型等［14］。浙江地区新生儿IMD 总患病率为0.22‰（1/4 535），患病率最高的为HPA，其次为PCD、MMA、SCADD、MCCD、希特林蛋白缺乏症、高甲硫氨酸血症等［15］。广州地区IMD 总患病率为0.41‰（1/2 451），患病率最高的为PCD，其次为MMA、PKU、SCADD、希特林蛋白缺乏症［16］。陕西地区IMD 总患病率为0.65‰（1/1 545），患病率最高的为HPA，其次为MMA、希特林蛋白缺乏症、PCD、中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症［17］。

本地区IMD 疾病谱及患病率与国内以上地区［14-17］不同。在本研究286 682例新生儿中，经基因检测共诊断IMD 180 例，包含28 个致病基因导致的23 种IMD，患病率最高的是PKU，其次是MMA、BH4D、希特林蛋白缺乏症、MCCD、鸟氨酸氨基甲酰转移酶缺乏症及枫糖尿病（maple syrup urine disease,MSUD），总患病率为0.63‰（1/1 593），本地区IMD总患病率低于同为西北地区的陕西，但要高于国内其他地区。推测这可能是由于西北地区经济水平欠发达，人口流动性有限，由于当地人群的建立者效应所致，需要扩大样本量进一步研究。

有效的IMD 治疗随访可降低对患儿的危害，MSUD为氨基酸代谢病的一种，患儿尿液会出现类似枫糖浆的气味［18］。该病是一种致死、致残的常染色体隐性遗传疾病，治疗困难，预后不良。本研究3 例MSUD 患儿中2 例来自同一家系，该家系在第1胎患儿明确诊断后没有进行产前诊断，导致第2 胎也为MSUD，因此，对患儿家庭进行有效的遗传咨询及生育指导十分重要。

携带者筛查技术可以检出携带同一种隐性遗传病致病基因的高风险夫妻，携带同一致病基因的高风险夫妻可通过产前诊断或胚胎植入前诊断来避免患儿的出生。随着测序技术的发展，扩展性携带者筛查病种已经有上百种［19］。但由于遗传病的疾病谱及患病率存在地域性差异，因此，不同地区应制定不同的筛查疾病种类。本研究结果显示，如果在扩展性携带者筛查的病种中添加PKU、MMA、BH4D、希特林蛋白缺乏症、MCCD、鸟氨酸氨基甲酰转移酶缺乏症、MSUD、极长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症、瓜氨酸血症1型、黏脂贮积症、肉碱酰基转移酶缺乏症这11 种IMD 时，可覆盖甘肃地区93.3%的IMD，可有效降低本地区IMD发生率。

综上所述，本研究对甘肃地区286 682 新生儿的IMD 疾病谱进行分析，发现28 种IMD。PKU、MMA、BH4D为本地区患病率最高的IMD。本研究在9个基因中发现了13个新变异位点，丰富了IMD相关致病基因变异数据库，为IMD 的分子遗传学诊断、干预治疗、生育指导及遗传咨询提供了理论依据与技术支持。

作者贡献声明：张钏负责实验操作、数据分析、论文撰写与修改、经费支持，惠玲、周秉博、郑雷、王玉佩、郝胜菊、达振强、马莹、郭金仙负责实验操作、数据分析、论文撰写与修改，曹宗富、马旭负责指导研究、论文修改、经费支持。

利益冲突声明：所有作者声明无利益冲突。