基于“肺主皮毛”理论在历代古方中挖掘最具美白祛斑潜力中药“二白一辛”

苏琳，邬宗周，余茜，邹纯朴，覃悦，张晓宇，朱杨壮壮，陈晓，胥孜杭（.上海中医药大学，上海 003；.上海市皮肤病医院，上海 00050）

“肺主皮毛”理论首见于《素问·痿论》，其高度概括了肺与皮毛的诸多关联，肺的宣发卫气及输布精微的功能是维持皮肤正常生理功能的基础，而皮肤的状态往往能够提示肺受邪毒的内在情况，所以不论是古籍医案还是现代临床，都不乏从肺论治皮肤的记载[1-3]。

中医药美白祛斑具有悠久的历史和丰富的内涵，在现存最早的方书《五十二病方》中，就收录了祛疣除瘢、美容外用方。随后在宋元、明清时期，美白祛斑方药得以进一步发展，如一直沿用至今的《太平圣惠方》中的“七白膏”、《医宗金鉴·外科心法要诀》中的“玉容散”等，方中常用入肺经及祛风药如白芷、白附子、细辛、白及、辛夷等，以期美白祛斑，依循了“肺主皮毛”理论，其功效更受到了现代科学的验证与肯定。但繁博的美白祛斑方至今尚未有深入挖掘和系统的整理，其用药规律及核心药物的美白祛斑机制是否遵循了“肺主皮毛”理论，还有待探索和验证。故本文对古籍中美白祛斑方挖掘整理，并基于“肺主皮毛”理论，利用网络药理学和生物学研究方法对美白祛斑方中核心药物的机制加以探索，以期探究美白方的用药规律，借助系统生物学丰富“肺主皮毛”理论在美白祛斑方中的科学内涵。

1 资料与方法

本研究的思路与方法示意图见图1。

图1 研究思路及方法示意图Figure 1 Schematic diagram of the research idea and methodology

1.1 数据收集分别以面光白、面光润、面光悦、面光泽、面光润、面光如镜、面白如玉、面白如脂、面黑令白、白净如玉、令人面白；面皯、面皯、面皯黯、面多皯、面生皯、除皯、面生黑皯疱、面䵟疱、䵟、面黑皯、黧黑斑、黧黑皯、面尘、面皯、雀斑、面生黑斑等为关键词，输入《中华医典》进行全面检索。 纳入含有中药组方或方名的文献数据；剔除无方无药、组方以及出处不详、重复出现者后，共得到相关文献194 篇，其中外用171 篇；内服23 篇，后续研究以外用方为主。

1.2 数据整理分析依据《中华人民共和国药典》《中华本草》将药物名称进行统一标准化处理，同一药材源自不同用药部位、同一药材的不同炮制品种给予保留。

1.3 数据分析采用Excel 2021 对每个方剂的来源、功效、组方配伍、用药数量分别进行统计。运用IBM SPSS Modeler 18.0 软件中关联规则Apriori 算法对高频药物进行药物关联规则分析，将最低支持度设定为10%，最小置信度为80%，最大前项数为5，按药物组合出现频数进行排序。

1.4 美白祛斑方核心中药的网络药理学分析

1.4.1 化学成分筛选 检索Symmap（http：//www.sym⁃map.org/）[4]、 TCMSP（https：//old.tcmsp- e.com/tcmsp.php[5]、 TCMID（http：//www.megabionet.org/tcmid）[6]、TCM-ID（http：//bidd.nus.edu.sg/group/TCMsite/）[7]数据库中中药的化学成分，通过PubChem（https：//pub⁃chem.ncbi.nLm.nih.gov/）获取成分的Canonical SMILES，通过Swiss ADME（http：//www.swissadme.ch/index.php）对活性成分进行筛选。

1.4.2 药物与疾病靶点获取 通过Swiss Target Predic⁃tion（http：//www.swisstargetprediction.ch/）平台对“二白一辛”中药活性成分所对应的靶点进行预测，筛选ProbabiLity≥0 的靶点，并使用UniProt（https：//www.uniprot.org/）数据库对靶点进行规范。以“skin whit⁃ening”（皮肤美白）、“skin pigmentation”（皮肤色素沉着）、“melasma/chloasma”（黄褐斑）、“freckle re⁃moving”（祛斑）、“photoaging”（光老化）、“melanin synthesis”（黑色素合成）、“melanin transport”（黑色素运输）、“melanin degradation”（黑色素降解）、“an⁃tioxidant”（抗氧化）为关键词，分别检索Genecards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//www.omim.org/）和DisGeNET（https：//www.disgenet.org/）数据库获得目标靶点并导入Excel，筛选关联性≥10 的靶点，得到美白祛斑靶点1 268个。

1.4.3 交集靶点获取及PPI 网络构建 将“1.4.2”项下的靶点导入 Eveen（http：//www.ehbio.com/test/venn/），得到交集靶点。将交集靶点上传至STRING（https：//cn.string-db.org/）数据库，设置信度＞0.400，构建蛋白相互作用网络（protein-protein interaction，PPI）；导入Cytoscape 3.8.2 软件中规范PPI 网络图，收集度值（Degree值）≥10的靶点。

1.4.4 GO 功能及KEGG 通路富集分析 将Degree≥10 的交集靶点上传至Metascape（https：//metascape.org/）中，进行GO 和KEGG 生物富集分析并对结果进行可视化处理。

1.4.5 构建“成分-靶点-通路”网络 根据“1.4.4”项下的靶点，反向查找“1.4.2”项下的活性成分，导入Cytoscape 3.8.2 软件中构建“成分-靶点-通路” 网络图，计算Degree值。

1.4.6 安全性预测 将上述Degree 值排前30位的成分通过化合物成分预测网站Pro Tox-II（https：//tox-new.charite.de/protox_II/）进行半数致死量［LD50（mg·kg-1）］和安全等级分析：Ⅰ级（致命毒；LD50≤5）、Ⅱ级（有毒；5＜LD50≤50）、Ⅲ级（有毒；50＜LD50≤300）、Ⅳ级（可能有毒；300＜LD50≤2 000）、Ⅴ级（可能有毒；2 000＜LD50≤5 000）、Ⅵ级（无毒；LD50＞5 000）。

非计划拔管的发生有医生、病人、管理、环境等多方面的主、客观因素,准确评估患者的各种导管,采取正确的固定方法、充分有效的沟通、适度镇静和约束管理,积极开展医护一体化和加速康复外科,可以有效预防并减少非计划性拔管的发生,保证患者安全。

1.4.7 分子对接 将上述Dgree 值排前30 位的靶点在PDB（https：//www.rcsb.org/）数据库中检索酪氨酸酶相关蛋白1（TYRP1）蛋白结构，在PubChem（https：//pubchem.ncbi.nLm.nih.gov/）数据库获取化合物的SDF格式文件，使用PyMol软件对靶点清除水分子和小分子配体，用AutoDock Tools 进行加氢与电荷处理。利用PyRx软件进行分子对接，计算结合能。

1.5 美白祛斑实验验证

1.5.1 细胞株、药物和试剂 人黑色素瘤细胞A375购自中科院上海细胞库。α-促黑激素（α-MSH）、大黄酚、没食子酸、咖啡酸，上海源叶生物科技有限公司，批号分别为：S48622、B20238、B20851、B20660；DMEM 高糖培养基、胎牛血清FBS、胰蛋白酶，上海亿泽丰生物科技有限公司，批号分别为：YBM-D、YS-FB500B、RA-10；MTT，上海碧云天生物技术有限公司，批号：ST316。

1.5.2 仪器 A2 生物安全柜、CO2细胞培养箱，美国Thermo 公司；CKX41 显微镜，日本Olympus 公司；5810R 台式多功能冷冻离心机，德国Eppendorf公司；SpectraMax190 型酶标仪，美国Molecular公司。

1.5.3 细胞毒性实验 将对数生长期的A375 细胞接种到96孔板中，细胞密度为每孔2×103个，过夜后更换为含药培养基，每个浓度设置5 个复孔。分别培养24、48、72 h后，每孔加入5 mg·mL-1MTT试剂10 μL，继续孵育4 h。弃上清，加入二甲亚砜（DMSO），振摇数次充分溶解紫色结晶，使用酶标仪在570 nm 处测定吸光度值。

1.5.4 黑色素含量检测 按每孔2×105个将A375 细胞铺于6 孔板，过夜后除正常对照组外，每孔加入1 μmol·mL-1α-MSH 刺激24 h，用不同浓度的大黄酚、没食子酸或咖啡酸处理细胞48 h。收获细胞并用PBS洗涤两次，用含10% DMSO的1 mol·L-1NaOH重悬，在80 ℃孵育2 h，用酶标仪在405 nm 处检测吸光度值。

1.5.5 统计学处理方法 采用SPSS 18.0软件对数据统计分析，所得结果用均数±标准差（±s）表示。两组间数据比较采用t检验；不符合正态性的数据采用秩和检验。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 白芷、白附子、细辛在美白祛斑方用药中频数最高经检索，《中华医典》中古代涉及美白祛斑的有效方剂共194 首，其中外用方剂共171 首，涉及261 味药物，中药出现总频数为1 309 次，其中出现频数≥10 次的药物共计33 味，使用最多的前3 位中药分别为白芷、白附子、细辛；其中，归肺经的中药共计16味，在频数≥10次的药物中约占50%，结果见表1。

表1 美白祛斑方中药物使用频数（频数≥10 次）Table 1 The frequency of Chinese medicinals used in whitening and freckle-removing external prescriptions（≥10 times）

2.2 辛温、肺经药物在美白祛斑方中最常用见图2。对美白祛斑方中的261 味中药进行药味、药性、归经统计。结果显示，辛、温、归肺经的药物占比最高。

图2 美白祛斑方中药物的药味、药性和归经Figure 2 The flavors，properties and meridian tropism of Chinese medicinals in whitening and freckle-removing external prescriptions

表2 美白祛斑方中药物组合关联规则TabLe 2 Association rules of Chinese medicinals combination in whitening and freckle-removing external prescriptions

图3 美白祛斑用药关联规则网络展示图Figure 3 Network display of the association rules for whitening and freckle-removing external prescriptions

2.4 古方挖掘中最具美白祛斑潜力中药“二白一辛”的美白祛斑功能验证

2.4.1 “二白一辛”的成分、靶点及与现代美白祛斑靶点的交集 通过Symmap、TCMSP、TCMID、TCMID 数据库对美白祛斑方中用药频数最高的白芷、白附子和细辛的有效成分进行检索，并通过SwissADME 对活性成分进行筛选。分别通过Swiss Target Prediction 获取上述活性成分的对应靶点，得到白芷995 个、白附子357 个、细辛820 个活性成分对应靶点，将其与美白淡斑相关的1 268 个靶点取交集，获得白芷155个、白附子59个、细辛127个交集靶点。见图4。

图4 美白祛斑方中高频中药白芷、白附子、细辛靶点与美白祛斑靶点的韦恩图Figure 4 Venn diagram of targets of high frequently used Chinese medicinals （Angelica Dahuricae Raix，Typhonii Rhizoma，Asari Radix et Rhizoma）in the whitening and freckle-removing external prescriptions and target of whitening and freckle-removing

2.4.2 “二白一辛” 美白祛斑关键靶点 通过STRING对交集靶点进行分析，并通过Cytoscape 3.8.2 整理PPI 互作网络，计算Degree 值，并根据Degree 值对靶点排序，节点越大越靠近中心的靶点Degree 值越高，白芷美白祛斑的关键靶点有TP53、AKT1、ALB 等；白附子美白祛斑的关键靶点有EGFR、JUN、STAT3等；细辛美白祛斑的关键靶点有ALB、AKT1、EGFR等（图5）。

图5 美白祛斑方中高频中药白芷、白附子、细辛美白祛斑靶点的PPI 网络图Figure 5 PPI network of whitening and freckle-removing target for high frequently used Chinese medicinals（Angelica Dahuricae Raix，Typhonii Rhizoma，Asari Radix et Rhizoma）in the whitening and freckle-removing external prescriptions

现代研究表明，抑癌基因TP53 可保护皮肤成纤维细胞免受紫外线等因素造成的DNA 损伤而引发凋亡[8-9]；表皮生长因子受体（EGFR）能够结合表皮生长因子以促进表皮细胞及全层皮肤组织的细胞增殖，上调皮肤细胞分泌透明质酸和糖蛋白[10]，合理调整皮肤结构，延缓皮肤衰老；白蛋白（ALB）能够促进受损皮肤的修复[11]，维护皮肤黏膜的完整性。

2.4.3 “二白一辛”美白祛斑生物富集分析 将上述Degree 值≥10 的交集靶点提交至Metascape，进行GO（Gene Ontology）功能注释及富集分析，包括生物学过程（Biological Process，BP）、 细胞组分（Cellular Component，CC）和分子功能（Molecular Function，MF）。“二白一辛”与美白祛斑相关的生物过程、细胞定位、分子功能密切相关：在生物学过程方面，白芷主要与细胞迁移的正向调节、细胞黏附的调节、对氧气水平的反应等有关；白附子主要与对激素的反应、细胞迁移的正向调节、细胞活化等有关；细辛主要与细胞迁移的正向调节、蛋白质磷酸化、对氧气水平的反应等有关。在细胞组分方面，白芷主要与膜筏、受体复合物、黏着斑等有关；白附子主要与膜筏、受体复合物、转录调节复合物等有关；细辛主要与受体复合物、膜筏、黑素体等有关。在分子功能方面，白芷主要与蛋白激酶活性、转录共调节子结合、蛋白质同二聚化活性等有关；白附子主要与核受体活性、磷酸酶结合、激酶结合等有关；细辛主要与蛋白激酶活性、转录因子结合、抗氧化活性等有关（图6）。

图6 美白祛斑方中高频中药白芷、白附子、细辛美白祛斑靶点GO 分析图Figure 6 GO analysis diagram whitening and freckle-removing target for high frequently used Chinese medicinals（Angelica Dahuricae Raix，Typhonii Rhizoma，Asari Radix et Rhizoma）in the whitening and freckle-removing external prescriptions

图7 KEGG 通路分析显示，白芷主要与HIF-1 信号通路、Th17 细胞分化、NF-κB 信号通路、脂肪细胞因子信号通路、黏着连接等有关；白附子主要与Th17 细胞分化、PI3K-Akt 信号通路、HIF-1 信号通路、MAPK 信号通路、长寿信号通路等有关；细辛主要与Th17 细胞分化、黏着连接、钙离子信号通路、NF-κB 信号通路、谷胱甘肽代谢等有关。这些信号通路通过对氧气的感知和反应，皮肤免疫调节，皮肤细胞的生长、分化、应激、炎症反应等多种途径实现“二白一辛”的美白祛斑功效。

图7 美白祛斑方中高频中药白芷、白附子、细辛美白祛斑靶点KEGG 分析气泡图Figure 7 KEGG analysis bubble diagram of whitening and freckle-removing target for high frequently used Chinese medicinals（Angelica Dahuricae Raix，Typhonii Rhizoma，Asari Radix et Rhizoma）in the whitening and freckle-removing external prescriptions

2.4.4 “二白一辛”美白祛斑活性成分预测 根据上述Degree 值≥10 的交集靶点分别反向查找白芷、白附子、细辛中的活性成分，筛选出白芷153个、白附子18个、细辛155个与美白祛斑相关的活性成分，通过Cytoscape 3.8.2 构建“成分-靶点-通路”网络，见图8。计算Degree 并选取排前30 位的活性成分作为白芷、白附子、细辛的潜在美白祛斑活性成分，评估有效成分的安全性并与黑色素形成核心蛋白酪氨酸酶相关蛋白1（TYRP1）进行分子对接，结果见表3。

表3 美白祛斑方中高频中药白芷、白附子、细辛美白祛斑相关活性成分预测Table 3 Prediction of active compounds of high frequently used Chinese medicinals（Angelica Dahuricae Raix，Typhonii Rhizoma，Asari Radix et Rhizoma）in the whitening and freckle-removing external prescriptions

图8 美白祛斑方中高频中药白芷、白附子、细辛的“成分-靶点-通路”网络图Figure 8 "Components-targets-pathways" network diagram of high frequently used Chinese medicinals（Angelica Dahuricae Raix，Typhonii Rhizoma，Asari Radix et Rhizoma）in the whitening and freckle-removing external prescriptions

2.4.5 “二白一辛”美白祛斑活性成分功效验证 根据“2.4.4”项下分子对接结果，“二白一辛” 与TYRP1结合最强的成分分别为大黄酚（Chrysophanol）、没食子酸（Gallic Acid）和α-荜澄茄油烯（Alpha-Cubebene），但由于α-荜澄茄油烯的制备原料短缺，无法获取，故选择细辛中结合能排第2位的咖啡酸（Caffeic Acid）进行实验验证。结果显示，大黄酚、没食子酸和咖啡酸对人黑色素瘤细胞A375 的抑制作用呈时间和剂量依赖性。大黄酚24、48、72 h 的IC50分别为187.1、142.2、90.8 μmol·L-1；没食子酸24、48、72 h 的IC50分别为111.5、50.0、29.2 μmoL·L-1；咖啡酸24、48、72 h 的IC50分别为199.1、139.4、66.39 μmoL·L-1，见图9。

图9 白芷、白附子、细辛有效成分大黄酚、没食子酸、咖啡酸对A375 的抑制作用Figure 9 Inhibitory effects on A375 of the active ingredients（chrysophanol，gallic acid and caffeic acid）of Angelica Dahurian Radix，Typhonii Rhizome and Asari Radix et Rhizoma

图10 黑色素含量检测显示，大黄酚、没食子酸和咖啡酸对α-促黑激素（α-MSH）诱导的A375的黑色素形成有一定抑制作用，其中，没食子酸和咖啡酸在50 μmol·L-1时即对A375 的黑色素产生发挥有效抑制作用（P＜0.05）。

图10 白芷、白附子、细辛有效成分大黄酚、没食子酸、咖啡酸对A375 黑色素表达的抑制作用Figure 10 Inhibitory effects of the active ingredients（chrysophanol，gallic acid and caffeic acid） of Angelica Dahurian Radix，Typhonii Rhizome and Asari Radix et Rhizoma on the expression of A375 melanin

3 讨论

3.1 “肺主皮毛”理论在历代美白祛斑方药中的体现“肺主皮毛”理论出自《素问·痿论》：“肺主身之皮毛”，是中医“整体观”的体现[12]，概括了肺与皮毛的联系，对指导养护皮肤及防治皮肤病有重要意义。现代医学研究[13]证明，肺与皮毛均由外胚层发育而来，具有组织胚胎学同源性。基于“肺主皮毛”理论，中医临床常从肺论治皮肤病：翟晓翔善用清燥润肺之法治疗银屑病、鱼鳞病、老年性皮肤瘙痒、慢性湿疹等[14]；陈明岭运用“疏风解表，清热凉血”之法，选方简化消风散加减以治疗急性痘疮样苔藓样糠疹[15]；此外，麻黄[16]、桂枝[17]、白芷[18]、白附子[19]等归肺经或味辛入肺之药及其有效成分也常运用于皮肤类疾病的治疗。但皮肤美白祛斑用药规律是否也遵循“肺主皮毛”理论，还鲜有研究。

美白祛斑的中医药应用已有两千多年的历史，医案方药繁多，如《备急千金要方》的面药篇、《外台秘要》的美容卷、《太平圣惠方》的治面皯诸方篇等。经整理，在众多美白祛斑方中，归肺经的药物占比最多；而在出现频率≥10 次的药物中，归肺经的药物更是占比近50%，这是从肺论治皮肤的直接体现。此外，在性味方面，辛味药占比最多，《素问·宣明五气》：“酸入肝，辛入肺……”辛能入肺，宣发肺气，这也能提示“肺主皮毛”是美白祛斑用药的理论依据，并进一步指导临床美白祛斑用药性味的选择。

3.2 “二白一辛”可能是最具美白祛斑活性的潜力中药在所纳入的美白祛斑方中，白芷、白附子和细辛是使用频率最高的核心药物，其中，白芷、白附子的美白祛斑功效古今皆有研究，如《神农本草经》记载白芷可“长肌肤，润泽，可作面脂”，这也是药糊面脂剂型最早的记载；现代研究[20]证明，白芷中的香豆素类和挥发油具有抑制酪氨酸酶活性、抗氧化以及减少黑色素生成的作用，由于白芷中的呋喃香豆素等具有光敏性[18]，所以古方常在夜间涂面，从而减少其副作用的发生。白附子在《本草纲目》录有“去面上诸风百病。疵皯，酒和贴之，自落”之效，《本草经集注》言其可治“面上百病”，经实验[21]证实，白附子的提取物具有通过抑制酪氨酸酶美白祛斑的作用。

“二白”的研究报道证明了本古籍挖掘结果与现代科学验证的一致性，而“一辛”则是首次以美白祛斑为功效进行古方及大数据分析。在本古籍文献挖掘中发现，细辛在美白祛斑方中的应用频率仅次于白芷、白附子，七白膏、玉容散、玉屑面脂等效方皆佐以细辛，且现代数据分析证明细辛具有美白祛斑的潜力。那么，细辛及其有效化合物成分的美白祛斑功效及在配伍过程中是否具有提高白芷、白附子等美白祛斑中药的作用，仍需进一步结合现代科学技术加以验证。

3.3 验证“二白一辛”的物质基础以丰富“肺主皮毛”理论的科学内涵为了丰富基于“肺主皮毛”理论美白祛斑的科学内涵，本研究基于古方挖掘，利用现代科学技术对最具美白祛斑潜力的“二白一辛”的美白祛斑作用加以验证。通过PPI 蛋白互作网络拓扑分析，筛选出白芷、白附子、细辛中的TP53、EGFR、ALB 等美白祛斑密切相关的核心靶点。GO及KEGG 生物富集分析提示了白芷、白附子、细辛美白祛斑可能与促进表皮干细胞迁移、调节皮肤细胞的生长及功能、抗氧化、调节黑色素代谢等美白相关通路有关。基于分子对接的结果，筛选出“二白一辛”有效成分大黄酚、没食子酸和咖啡酸，通过分子生物学研究证明这些有效成分对黑色素瘤细胞的增殖及黑色素产生的抑制作用。根据美白祛斑靶点所筛选得到的“二白一辛”有效成分，不仅规避了中药成分复杂而导致的皮肤用药安全性，更为基于“肺主皮毛”理论的临床皮肤美容用药和产学研结合提供了支持。

3.4 促进多学科交叉合作方能最大程度发掘古方精华“守中医之正，创医学之新”，是推进中医药现代化的要求，将中医药与现代科学交叉融合，培育中医药交叉学科，是实现中医药现代化的有力抓手。清华大学北京市中医药交叉研究所所长李梢基于网络药理学和定量分析方法，建立了中医药分子网络导航系统，实现现代医学生命科学积累的大数据为中医药所用，是多学科交叉的范例[22]。中医古方繁博，唯有利用学科交叉合作才能最大程度挖掘精华[23]。作为抛砖引玉，本文即是古代文献挖掘、网络药理学及分子生物学的学科交叉运用，而如何进一步证明细辛等药物及其有效成分的美白祛斑作用并服务于临床还有待其他学科的研究补充：如利用药剂学、材料化学等促进药物透皮吸收；利用中药炮制学、药物化学等减毒增效；利用临床医学验证美白祛斑疗效等，从而实现多学科延伸，促进中医古方及理论的现代化应用。

综上，经古方挖掘证明，美白祛斑方的用药是“肺主皮毛”理论从肺论治皮肤病的体现，其核心药物“二白一辛”在现代科学技术的验证下，得到了其美白祛斑作用的主要靶点、通路及潜在有效成分，基于学科交叉运用，我们丰富了在美白祛斑用药中“肺主皮毛”理论的科学内涵。但由于中药成分复杂，本研究仅基于已有报道的化合物进行分析，其完整的有效成分无法得到彻底的体现，所以无法充分剖析其美白祛斑的作用机制；网络药理学结合实验验证所得到的有效成分仍然有限，还需结合药理学进一步探索验证。但“二白一辛”，尤其是细辛及其活性成分，仍不失为美白祛斑的新型潜力用药，值得深入探索。