P16/Ki-67双染、TCT细胞学、HPV联合检测技术在宫颈病变筛查中的应用价值分析

胡红霞

（酒钢医院病理科，甘肃 嘉峪关，735100）

宫颈癌（cervical carcinoma）是妇科常见的恶性肿瘤，当前宫颈癌的发病人数逐年增加，且有明显低龄化的趋势[1-2]。宫颈癌的早期诊断对改善患者预后具有重要价值，且宫颈病变进展到宫颈癌的时间比较长，也为早期诊断提供了基础。宫颈病理组织学检查是临床诊断宫颈癌的金标准，但是诊断的成本比较高，且对患者造成创伤[3]。液基薄层细胞学检查（TCT）是利用宫颈刷刷取宫颈表面及部分宫颈管以获取脱落细胞，经专业制片，提高细胞学制片质量，并分类、判断细胞，提高宫颈病变的检出率[4]。绝大部分宫颈癌患者是由人乳头状瘤病毒（Human papilloma virus，HPV）所引起的，长期持续感染高危型HPV 病毒会导致宫颈高级别上皮内瘤变，诱发形成宫颈癌[5]。P16 在细胞周期的阻滞期具有抑制细胞增殖的功能，Ki-67 是细胞增殖的标记物，P16/Ki-67 双染检测能够检测出HPV 持续感染情况，可反映宫颈病变的程度[6-7]。本研究具体探讨与分析了P16/Ki-67 双染、TCT 细胞学、HPV 联合检测技术在宫颈病变筛查中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2022 年4 月—2023 年4 月在酒钢医院妇科门诊及住院自愿行宫颈病变筛查且后期进行宫颈组织活检的就诊人群83 例作为研究对象。在83 例人群中，绝经期妇女16 例，未绝经妇女67 例；平均年龄（43.70±10.39）岁；平均身体质量指数（22.44±1.78）kg/m2；平均受教育年限（15.92±1.48）年。所有患者及家属均知情同意参与本研究并签署知情同意书。本研究得到了酒钢医院医学伦理委员会的批准。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：所有人群在检查前3 d 无性生活、阴道上药等行为；有性生活史。

排除标准：存在宫颈手术史的人群；此次筛查前存在HPV 感染者；合并其他部位肿瘤者；依从性不佳者。

1.3 TCT 细胞学检查

所有人群都给予TCT 细胞学检查，使用窥器暴露宫颈，棉签擦净宫口分泌物，使用TCT 专用刷置入宫颈管内，采集患者阴道或宫颈分泌物。取出后放入规定容器（含有液基细胞处理试剂）中，反复洗涮约10 次，确保无血细胞、黏液，盖紧瓶盖，送检病理科。利用DL-10 离心涂片机（生产企业：湖北德力森科技有限公司）将细胞制成薄层细胞涂片，巴氏染色后在显微镜下观察宫颈上皮细胞的阳性情况。

1.4 P16/Ki-67 双染检查

细胞样本采集、制片同TCT 细胞学检查，采用P16/Ki-67检测试剂盒（生产企业：河南赛诺特生物技术有限公司，豫郑械备20200097 号），采用免疫细胞化学法对细胞制片进行P16/Ki-67 免疫化学双染色。阳性判读标本：光学显微镜下同一个视野中观察发现至少存在1 个细胞同时胞核呈红色（Ki-67）、胞质呈棕色（P16）的宫颈细胞为阳性细胞。

1.5 HPV 检查

采用杂交捕获化学发光法，利用HPV 核酸检测试剂盒（生产企业：瑞士罗氏公司，P/N：05235880190）检测HPVl6/18 型核酸含量，样本测量值/参考值，≥1.0 判定为宫颈癌阳性。

1.6 病理检查

所有人群都给予病理组织学检查，对可疑病变部位进行多点组织活检，严格进行宫颈活检病理分级。包括正常组织、cervical intraepithelial neoplasia（CIN）1 级（炎性反应）、CIN 2级、CIN 3 级等级别，以CIN 2 级+CIN 3 级判断为高级别上皮内瘤变，正常组织与炎性反应组织为非病变组织。同时以病理组织检查作为诊断的金标准，判断上述方法联合检测的敏感性与特异性。

联合检测阳性标准：只要P16/Ki-67 双染阳即可判断为阳性。

1.7 统计学分析

采用SPSS 22.0 统计软件对数据进行分析处理，计数资料用[n（%）]表示，计数数据的对比采用χ2检验，当n≥40，且至少一个1≤T＜5，采用校正χ2检验；计量资料以（）表示，比较采用t 检验。以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 P16/Ki-67 双染、TCT 细胞学、HPV 检查的阳性率对比

在83 例患者中，病理检查为正常组织21 例、CIN 1 级47例、CIN 2 级12 例、CIN 3 级3 例，其中高级别上皮内瘤变占18.07%。HPV 检查阳性71 例，TCT 细胞学检查阳性37 例，P16/Ki-67 双染检查阳性16 例。P16/Ki-67 双染、TCT 细胞学、HPV 检查对高级别上皮内瘤变检查阳性率分别为62.50%（10/16）、27.03%（10/37）、21.13%（15/71），不同病理分级患者的P16/Ki-67 双染、TCT 细胞学、HPV 检查阳性率对比差异有统计学意义（P＜0.05），CIN 3 级与CIN 2 级的P16/Ki-67 双染阳性率高于正常组织与CIN 1 级（P＜0.05），CIN 3 级、CIN 2 级、CIN 1 级的HPV 阳性率高于正常组织（P＜0.05），见表1。

表1 不同病理分级宫颈病变患者的P16/Ki-67 双染、TCT 细胞学、HPV 检查阳性率对比 [n（%）]

2.2 联合检测与单独检测对宫颈病变的诊断敏感性与特异性分析

在83 例患者中，正常组织、CIN 1 级、CIN 2 级、CIN 3 级患者的联合检测阳性率分别为4.76%、10.64%、66.67%、66.67%。P16/Ki-67 双染、TCT 细胞学、HPV 检查单独检测与联合检测对宫颈病变的诊断敏感性分别为66.67%（10/15）、66.67%（10/15）、100.00%（15/15）、66.67%（10/15），诊断特异性分别为91.18%（62/68）、60.29%（41/68）、17.65%（12/68）、91.18%（62/68），见表2。

表2 宫颈病变患者联合检测与单独检测的诊断敏感性与特异性（n）

3 讨论

3.1 不同病理分级患者的P16/Ki-67 双染、TCT 细胞学、HPV检查阳性率有显著差异

本研究显示，在83 例患者中，高级别上皮内瘤变占18.07%。P16/Ki-67 双染、TCT 细胞学、HPV 检查对高级别上皮内瘤变检查阳性率分别为62.50%、27.03%、21.13%。不同病理分级患者的P16/Ki-67 双染、TCT 细胞学、HPV 检查阳性率对比差异有统计学意义（P＜0.05）。正常组织、CIN 1级、CIN 2 级、CIN 3 级患者的联合检测阳性率分别为4.76%、10.64%、66.67%、66.67%，表明不同病理分级患者的P16/Ki-67 双染、TCT 细胞学、HPV 检查阳性率有显著差异。宫颈癌是女性生殖系统第二大常见肿瘤，多数为持续性高危型人乳头瘤病毒感染所致。宫颈癌的具体发病机制还不明确，但是由宫颈病变发展而来，且发展周期比较长[7]。宫颈病变的病因除了HPV 感染外，还包括吸烟、性生活紊乱、性生活过早、基础免疫低下等。宫颈病变的预后一般较差，但是进行早期诊断，可有效逆转这个阶段，预防宫颈癌的发生[8]。现代研究表明，宫颈癌筛查不仅要提高敏感度，还要提高特异度，从而有效提高准确诊断性[9]。在常规检测方法中，TCT 是将宫颈样本病变细胞收集于特别保存液中，制成的细胞标本均匀清晰[10]。HPV 是一种双链闭环的DNA 病毒，容易发生免疫逃逸，使得机体出现HPV 感染，增加致癌风险。研究显示，HPV 阳性人群多为低级别鳞状上皮内病变（LSIL）、细胞学为意义不明确的非典型鳞状上皮细胞（ASC-US）[11]。p16/Ki-67双染是近年来在广泛使用的免疫细胞化学方法，p16 蛋白对细胞增殖和分裂起负调节作用，是细胞周期依赖性激酶抑制剂，是受转录活化因子E2F 蛋白（E2F transcription factors）活化的下游靶基因。当机体感染HPV 后，致使pRb-E2F 复合物中的E2F 解离为游离状态，可促进宫颈病变的进一步发展，最终导致宫颈癌[12]。作为一种细胞增殖标志物，Ki-67 是增殖性细胞核抗原。在P16/Ki-67 双染中，随着CIN 病变程度的进展，P16/Ki-67 双染的阳性率也会增高。TCT 检查在涂片过程中对于技术操作的要求比较高，容易出现假阴性状况。TCT 检查的特异性比较高，但灵敏度低，容易出现漏诊。HPV检测在操作上比较方便，但是HPV 阳性率过高导致过高的阴道镜转诊率，主要在于HPV 灵敏度高，无法区分一过性感染和转化性感染情况[13]。P16/Ki-67 可有效区分宫颈上皮内病变并分级，有研究显示，P16/Ki-67 双染检测能够检测出HPV持续感染后过度表达P16 与Ki-67 的宫颈病变状况，特别是双染阳性可提示患者处于CIN 2 级病变及以上，帮助临床医生对患者进行精准对症治疗，进而实现早期干预[14]。

3.2 P16/Ki-67 双染、TCT 细胞学、HPV 联合检测技术在宫颈病变筛查中的应用具有更好的效果

本研究显示，P16/Ki-67 双染、TCT 细胞学、HPV 检查单独检测与联合检测对宫颈病变的诊断敏感性分别为66.67%、66.67%、100.00%、66.67%，诊断特异性分别为91.18%、60.29%、17.65%、91.18%，表明三者联合检测的敏感性较高，而P16/Ki-67 双染单独检测的特异性最高，导致联合检测的特异性也最高。从机制上分析，目前宫颈病变联合筛检（TCT细胞学及HPV 检测）存在的问题：（1）TCT 检查中，许多阅片医生未经过规范化细胞学诊断培训，细胞学医生实际工作量远超理论工作量，阅片压力大，导致风险产生[15-16]；并且细胞学医生的诊断存在主观性，不同的细胞学医生做出来的诊断结果不同，导致诊断结果一致性较差。（2）HPV 在检测中的阳性率一直过高，容易导致出现患者过度诊疗[17]。而P16/Ki-67 双染检测技术采用的是细胞化学免疫法，依靠颜色判读结果，不受主观影响，结果判读简单且稳定[18]。采用P16/Ki-67 双染、TCT 细胞学、HPV 联合检测技术，不仅所需标本易获取，无创伤，患者依从性强，而且P16/Ki-67 双染弥补了TCT 细胞学敏感性不足、HPV 敏感性过高而特异性低等问题，因此未来宫颈病变筛查中提倡三者联合检测，三者取长补短相互弥补不足，一般双染阳性的再建议宫颈组织活检，能够降低阴道镜转诊率，有很好的应用价值[19-20]。

综上所述，P16/Ki-67 双染、TCT 细胞学、HPV 联合检测技术能更准确地发现潜在的高级别病变患者，提高宫颈病变检出率，有很好的应用价值。本研究由于进行宫颈组织检查的人群较少，导致纳入筛查的人群比较少，且不同检查方法的分类也比较少，病理组织检查也存在一定的差异性，将在后续研究中进一步探讨。