双特异性抗体药物细菌内毒素检查法的建立

段 颖，李肖肖，秦国宏

南京正大天晴制药有限公司，江苏 南京 210046

双特异性抗体凭借其靶点结合的特殊性，作用机制灵活，相应的药物在疾病治疗领域中发挥了超越天然抗体的优势[1]。从安全用药角度考虑，将其应用于临床试验中时，必须严格控制药物中细菌内毒素的含量[2]。

细菌内毒素存在于革兰氏阴性菌外膜中。细菌在死亡或自溶后就会释放出内毒素，随着给药进入体内后可引发严重的不良副作用[3]。基于内毒素可以特异性激活负责鲎血液凝固的蛋白酶原这一原理，凭借操作简单的优势，凝胶法被广泛应用于药物的内毒素污染控制中。鉴于鲎资源的稀缺性，并且该方法本身容易受到的干扰因素众多，加之其仅能作为定性方法被应用，在多方面因素的作用下，建立稳健替代方法迫在眉睫[4-5]。

重组C 因子法在内毒素检测方面具有高度特异性[6]。重组C 因子作为改造的稳定蛋白，与内毒素结合后识别并催化下游底物发出荧光信号。信号强度与内毒素含量呈正相关，因此可以定量检测内毒素含量。该方法无需用到天然鲎变形细胞，保护了鲎资源。本研究建立了双抗药物的细菌内毒素质量控制方法，并开展了方法学研究[7]。

1 仪器与试药

1.1 主要仪器

生化培养箱(上海一恒公司)，生物安全柜（苏州安泰公司），多功能酶标仪（Molecular Devices 公司）。

1.2 试药

细菌内毒素工作标准品（批号202088，规格60 EU/支，中国食品药品检定研究院）；细菌内毒素检查用水（批号2012220，湛江安度斯生物有限公司）；鲎试剂（批号22022412，灵敏度0.25 EU/mL，规格0.1 mL，福州新北生化工业有限公司）；重组C 因子试剂盒（批号RF010210401，RF010220201，Adamas life 公司）；原液（批号20211102，内毒素限值低于15 EU/mL，南京正大天晴制药有限公司）。

2 方法与结果

2.1 凝胶法检测

取一支细菌内毒素工作标准品，加入1 mL 检查用水复溶，涡旋15 min 后即得到浓度为60 EU/mL 的内毒素标准品溶液。后续不同浓度的内毒素标准品溶液均由该溶液稀释得到。

参照中国药典中最大有效稀释倍数计算公式，确定原液最大稀释倍数为60。取原液用检查用水配制成60 倍稀释浓度的供试品溶液。取0.1 mL 供试品溶液向其中加入鲎试剂0.1 mL，平行制2 管作为供试品阴性对照组；用60 倍稀释浓度的供试品溶液同比例稀释1 EU/mL 的内毒素工作标准品，并取0.1 mL 稀释后的溶液向其中加入鲎试剂0.1 mL，平行制2 管作为供试品阳性对照组；分别取0.1 mL 检查用水和0.5 EU/mL 内毒素工作标准品向其中加入鲎试剂0.1 mL，分别作为阴性对照和阳性对照组，每组平行制2 管。将配制完成的溶液样品用封口膜封口，涡旋混匀后于37 ℃培养箱中反应60 min。

依据中国药典凝胶限度试验中的结果判定规则对检测结果进行分析。

2.2 重组C 因子法建立

2.2.1 样品制备

在无热原玻璃试管中用检查用水将60 EU/mL的内毒素标准品溶液进行梯度稀释。稀释后浓度分别为2.5、1.5、0.5、0.1 EU/mL，作为线性标准溶液。

根据供试品的内毒素限值确定其对应的稀释倍数。对于原液，选定稀释倍数为30。

2.2.2 试液加入

分别取100 μL 检查用水、线性标准溶液、稀释后的样品加入96 孔无菌酶标板相应孔中，每组做2复孔。检测样品均设置加标样品组，向100 μL 稀释后的样品中加入10 μL 浓度为5 EU/mL 的内毒素标准品溶液，同步做2 复孔。

将加样后的酶标板放置在37 ℃培养箱中预热15 min。将试剂盒中的荧光底物溶液、测定缓冲液和重组C 因子酶溶液按照5∶4∶1 的比例混合后按照100 μL/孔的量加入检测孔中。加入底物试剂后将酶标板放置在37 ℃培养箱中反应1 h。分别在0 h 和1 h 时读取荧光值。酶标仪设置激发和发射波长分别为380 nm 和440 nm，荧光增益强度设为中等，每个孔扫描6 次。

2.2.3 结果分析

线性标准溶液和样品的荧光信号值均扣去阴性对照信号值以排除本底干扰，得到相对荧光信号值（Relative Fluorescence Unit，RFU）。以线性标准溶液的净相对信号的对数值logδRFU 为纵坐标，内毒素浓度为横坐标进行线性拟合，拟合线性方程如下。线性相关系数r 不应小于0.950。

通过拟合的线性方程计算样品加标回收率，回收率在50%～200%范围内就可判定供试品对检测无干扰。计算加标回收合格的稀释后供试品溶液的内毒素含量，再根据稀释倍数计算未稀释的供试品中内毒素含量。

2.3 重组C 因子法验证

2.3.1 专属性

鲎试剂凝集系统中存在G 因子反应旁路，可以被β-葡聚糖激活产生细菌内毒素检查的“假阳性”，因此会干扰凝胶法的专属性。所以还需考察β-葡聚糖是否会对重组C 因子法也产生干扰，对此，本研究制备0.1 μg/mL 的β-葡聚糖溶液进行重组C 因子法检测，并计算相应的加标回收率。

该方法下并未检出β-葡聚糖，加标回收率为71.4%，满足回收率要求。结果表明重组C 因子法专属性强，C 因子未与β-葡聚糖发生交叉反应。

2.3.2 线性

配制系列浓度为2.5、1.5、0.5、0.1 EU/mL 的内毒素线性标准溶液开展重组C 因子法检测。以logδRFU 为纵坐标，内毒素浓度为横坐标进行线性回归并分析其相关系数。重复线性实验3 次，3 次的相关系数r 均需满足不小于0.950 的要求。结果表明内毒素含量在0.1～2.5 EU/mL 范围内时，该方法的线性关系良好。

2.3.3 准确度

平行制备0.5、1.0、1.5 EU/mL 的内毒素标准品溶液各3 份进行检测。代入线性方程中计算内毒素含量，将内毒素含量实测值与理论值进行比较计算回收率。计算得到0.5 EU/mL 标准品溶液的回收率为88%～120%；1.0 EU/mL 的回收率为88%～97%；1.5 EU/mL 的回收率为97%～104%。结果表明该方法的准确度较高。

2.3.4 精密度

由2 位实验人员于不同日期分别平行制备0.5、1.0、1.5 EU/mL 的内毒素标准品溶液各3 份进行检测。代入线性方程中计算内毒素含量。实验人员1 测得的3 种浓度内毒素含量的SRSD作为重复性结果，SRSD均不超过15.7%。2 实验人员测得的3 种浓度6次结果的SRSD均在24.2%～32.7%之间。结果表明该方法的精密度良好。

2.3.5 耐用性

反应时间出现微小波动（57 min 和63 min）时测得1.0 EU/mL 标准溶液内毒素含量的SRSD为12.1%。2 个批次试剂盒检测3 份1.0 EU/mL 标准溶液共6 次结果的SRSD为8.3%。表明该方法耐用性较强。

2.4 内毒素检测

分别采用两种方法对20211102 批原液进行内毒素检查。凝胶法测得原液符合低于15 EU/mL 的内毒素限定标准。重组C 因子法测得原液内毒素含量为3.9 EU/mL。相比于凝胶法，重组C 因子法可以给出定量结果。

3 讨论

药品中含有大量的内毒素会对人体造成严重的危害，因此检测内毒素含量是包括双特异性抗体在内的生物制品质量控制的重要环节。鉴于对鲎资源的保护和凝胶法的专属性，重组C 因子法越来越有替代凝胶法的趋势。市面上试剂盒种类繁多，如何基于项目特性和现有的仪器状态建立稳健的重组C因子法需要进行进一步探究。

本研究针对双特异性抗体药物建立了重组C因子内毒素检查法，经验证该方法具有可实用性。重组C 因子法对β 葡聚糖无反应，同时线性范围、准确度、精密度和耐用性均能够符合要求。2 种方法的内毒素检测结果表明重组C 因子法可以作为定量法准确提供内毒素含量，更利于研发团队对内毒素水平进行控制。

综上所述，本文建立的方法适用于双特异性抗体药物的内毒素定量检测，对其他抗体药的重组C因子检查法的建立具有借鉴意义。