基于孟德尔随机化方法探讨炎症性肠病与骨质疏松性骨折的因果关系

陈尚桐, 陈跃平, 宋世雷, 黄川洪

(1. 广西中医药大学研究生院, 广西 南宁 530001; 2. 广西中医药大学附属瑞康医院创伤骨科与手外科, 广西 南宁 530011)

骨质疏松症是一种以全身骨量下降合并骨组织微结构损坏、骨脆性增加,易发生骨折为特征的全身性骨病[1］。骨质疏松性骨折是骨质疏松症最严重的并发症之一,其定义是指受到轻微外伤即发生病理性骨折[2］。基于多项研究表明,全身性的炎症反应与骨质疏松性骨折发生的关系密切,其中最为重要的病理机制在于骨髓间质干细胞在炎症因子的介导下加速破骨细胞成熟,导致骨质疏松性骨折的发生[3-4］。炎症性肠病包括溃疡性结肠炎和克罗恩病,是一种自身免疫性的慢性非特异性肠道炎症性疾病,且炎症性肠病的发病率逐日上升[5］。炎症性肠病能够诱导全身炎症反应,既往有研究表明炎症性肠病可使患者骨密度降低,引发全身性骨质疏松症,导致病理性骨折频发,严重影响患者的身心健康[6］。目前炎症性肠病患者骨密度降低的发病机制尚不明确,针对该类患者骨密度降低的治疗仍缺乏有力的证据支持,炎症性肠病与骨质疏松性骨折之间是否存在因果关系尚无基因层面的明确定论,因此学术界对于炎症性肠病患者骨密度降低的问题仍未获得足够重视[7］。然而,骨质疏松性骨折作为老年患者致残和致死的主要原因,进一步明确炎症性肠病是骨质疏松性骨折发病的危险因素,对制定有效的预防及治疗措施具有重要的指导意义。

孟德尔随机化(Mendelian randomization,MR)能够达到模拟随机对照试验的目的,以遗传变异为工具变量,遵循等位基因在受孕时随机分配且固定的原则,能排除混杂因素的潜在干扰,有效降低因果关系估计值的偏倚,加强了因果推断[8］。因此本研究选取炎症性肠病中溃疡性结肠炎和克罗恩病,以及骨质疏松性骨折样本进行孟德尔随机化的研究,以明确炎症性肠病与骨质疏松性骨折之间存在的因果关系。

1 资料与方法

1.1 研究设计

本研究将骨质疏松性骨折作为结局变量,选取与炎症性肠病(暴露因素)中的克罗恩病与溃疡性结肠炎显著相关的单核苷酸多态性(SNPs)作为工具变量,使用两样本孟德尔随机化分析的方法进行暴露因素与结局变量因果关联分析。为验证结果可靠性,采用异质性检验、敏感性分析、多效性分析来排除结果偏倚。本文采用了以下三个关键假设达成孟德尔随机化满足:① 工具变量与暴露因素之间存在较强的相关性;② 工具变量与暴露因素-结局变量关联的任何混杂因素不相关;③ 工具变量只能通过与暴露因素的关联影响结局。

1.2 数据来源

通过IEU数据库分别获得炎症性肠病和骨质疏松性骨折的遗传数据。其中克罗恩病与溃疡性结肠炎的数据均来源于Liu JZ团队的GWAS研究[9］,克罗恩病数据集的样本量为20 883,SNPs数量为12 276 506;溃疡性结肠炎样本量为47 745,SNPs数量为156 116。骨质疏松性骨折的遗传数据则来自于芬兰数据库(The FinnGen Biobank),该数据库收集并分析了来自50万芬兰参与者的基因组和健康数据,其样本量为173 619,SNPs数量为16 380 281。为避免因人种差异相关混杂因素,研究人群的遗传背景选择欧洲人种。基本信息见表1。

1.3 工具变量

以千人碱基对项目作为本次研究的参照[10］。选择与暴露因素显著相关并且相互独立的SNPs,相关参数设置为:P<5.0×10-8,单个SNP的F>10,计算公式为F=β2/SE2,其中β为等位基因频率,SE为估计标准误差。为排除连锁不平衡的干扰,设置连锁不平衡参数r2阈值为0.001,千碱基对为10 000 kb。采用MR PRESSO检验将存在显著异质性的SNP剔除,筛选出与暴露因素显著相关的有效SNP作为本次研究的工具变量。

1.4 孟德尔随机化分析

采用R 4.2.0中的“TwoSampleMR”包进行孟德尔随机化分析,本次研究使用逆方差加权(IVW)法作为主要分析,评估暴露因素与结局之间存在的风险。采用MR-Egger回归法、加权中位数(Weighted Median,WME)法、简单模式(Simple Mode)法以及加权模式(Weighted Mode)法进行辅助因果推断,以此评估IVW结果的可靠性,若上述结果的方向均与IVW结果一致,即认为孟德尔随机化分析结果可靠,P<0.05为存在统计学差异。F值设定为>10,即表示不存在弱工具变量偏倚,计算公式为F=R2(N-2)/(1-R2)[11］,其中R2为暴露数据库中由SNPs解释的变异占比,N为暴露的GWAS样本量。

1.5 异质性检验、敏感性分析、多效性分析

本研究采用IVW法、MR-Egger法进行异质性检验,当P>0.05时,认为SNPs之间不存在异质性。采用MR_leaveoneout_plot函数进行敏感性分析并将结果可视化,剔除单个SNP观察是否对最终结果存在影响。采用MR_pleiotropy_test函数以及MR PRESSO法进行多效性分析,当P>0.05时,表示不存在多效性[12-13］。

2 结果

2.1 工具变量

在使用clumped函数去除连锁不平衡后,克罗恩病剩余52个SNPs,溃疡性结肠炎剩余88个SNPs。本次研究单一SNP对应的F值均>10,不存在弱工具变量偏倚,本结果可靠。

2.2 孟德尔随机化分析结果

在克罗恩病与骨质疏松性骨折分析结果中,IVW法具有统计学意义[OR(95%CI):1.12(1.03-1.22),P=0.006],提示克罗恩病是骨质疏松性骨折的危险因素;WME法分析结果同样证明克罗恩病合并骨质疏松性骨折风险增高,差异有统计学意义[OR(95%CI):1.15(1.01-1.32),P=0.02];MR-Egger回归[OR(95%CI):1.16(0.94-1.44),P=0.15]、Simple Mode法[OR(95%CI):1.15(0.88-1.50),P=0.28]以及Weighted Mode法[OR(95%CI):1.16(0.97-1.39),P=0.10]不支持克罗恩病是骨质疏松性骨折的危险因素,但5种方法的因果效应方向均一致。在溃疡性结肠炎与骨质疏松性骨折分析结果中,IVW法、MR Egger法、WME法的结果均具有统计学意义,OR(95%CI)分别为1.15(1.03-1.28),1.35(1.03-1.75),1.18(1.01-1.37),P均<0.05,提示溃疡性结肠炎是骨质疏松性骨折的危险因素;Simple Mode法[OR(95%CI):1.15(0.86-1.55),P=0.32]以及Weighted Mode法[OR(95%CI):1.19(0.96-1.47),P=0.10]结果不支持克罗恩病是骨质疏松性骨折的危险因素,但5种方法的因果效应方向均一致。见图1。数据可视化分析说明5种方法下暴露因素克罗恩病、溃疡性结肠炎整体SNP的效应升高,结局变量骨质疏松性骨折的SNP效应同样升高。并且当暴露因素SNP效应为0时,结局变量同样为0,说明该结果不受水平多效性的影响。见图2。

图1 孟德尔随机化分析森林图

图2 孟德尔随机化分析结果图

2.3 异质性检验、敏感性分析、多效性分析

异质性检测中,克罗恩病与骨质疏松性骨折的IVW法P=0.55,MR-Egger法P=0.52;溃疡性结肠炎与骨质疏松性骨折的IVW法P=0.23,MR-Egger法P=0.25,均提示SNPs之间并不存在异质性。漏斗图呈现出大致对称的形状,提示本次研究受异质性的影响造成结果偏倚的可能性小(图3)。敏感性分析采用MR_leaveoneout_plot函数逐个提出SNP后,克罗恩病与骨质疏松性骨折、溃疡性结肠炎与骨质疏松性骨折的IVW分析结果与纳入全部SNPs的分析结果接近,未发现对因果关联估计值影响较大的SNP(图4)。多效性分析中,克罗恩病与骨质疏松性骨折的MR_pleiotropy_test函数结果提示P=0.69,MR PRESSO法P=0.55;溃疡性结肠炎与骨质疏松性骨折的MR_pleiotropy_test函数结果提示P=0.20,MR PRESSO法P=0.24;结果均提示本次研究不受水平多效性影响。

图3 两样本孟德尔随机化结果漏斗图

图4 “Leave-one-out”敏感性分析结果

3 讨论

本次两样本孟德尔随机化研究验证了炎症性肠炎和骨质疏松性骨折之间的因果关系。其中在克罗恩病与骨质疏松性骨折分析结果中,IVW法、WME法分析结果存在统计学意义,其余方法分析结果方向一致;在溃疡性结肠炎与骨质疏松性骨折分析结果中,IVW法、MR Egger法以及WME法结果存在统计学意义,其余方法分析结果方向一致。因此该结果提示炎症性肠炎和骨质疏松性骨折的因果效应保持稳定。Lewandowski等[14］对431例样本研究发现,有7.3%的炎性肠炎患者合并骨质疏松症,炎性肠炎患者患骨质疏松症的风险显著高于健康者。Ratajczak等[15］研究结果表明36%的炎性肠炎患者合并骨质疏松症。Saadah等和Jin等[16-17］学者发现患克罗恩病的儿童及青少年相较于成人同样存在较高骨密度降低的风险。Targownik等[18］研究结果表明,克罗恩病患者中一个或多个部位(双侧髋关节、股骨颈、大粗隆、腰椎)的骨质疏松性骨折风险相对增加约50%。Hidalgo等[19］的Meta分析中,炎性肠炎与骨质疏松性骨折发生风险存在显著相关性。Bartko等[20］在531例炎症性肠病患者的临床研究中发现,炎性肠炎与老年患者的髋部骨折密切相关,并且克罗恩病女性中死亡风险显著升高。Wong等[21］针对小儿炎症性肠病的研究结果表明,炎性肠炎能够引起全身的慢性炎症,即使不使用糖皮质激素,椎体骨折的风险也会增加。本次孟德尔随机化结果与上述临床观察一致,进一步说明了结果的可靠性。

目前,炎症性肠病被认为与骨量降低、脊柱炎、关节炎以及全膝关节置换术后并发症等骨科疾病关系密切[22-23］。有研究表明炎症性肠病患者体内的钙、镁、锌和磷等电解质水平偏低,钙、镁、锌、磷的代谢异常均能诱导骨质疏松性骨折的发生[24-26］。炎症性肠病患者肠道吸收不良,维生素D、维生素K的缺乏同样是影响患者骨密度的重要因素[27-28］。炎症性肠病诱导的全身炎症是导致骨质疏松性骨折的又一重要原因[29］。本研究中rs2188962位于5号染色体上、是C5orf56基因的内含子,rs1887428位于9号染色体上、是JAK2基因5′端的非翻译区,有文献报道称该类遗传变异与全身炎症的关系密切[30-31］。学术界普遍认为核因子κB受体活化因子配体(RANKL)与骨保护素(OPG)比值的失衡在炎症性肠病导致骨质疏松症中起到关键的作用。炎症性肠病通过全身多种免疫细胞介导引起全身炎症反应,大量细胞因子在该过程中被激活,例如肿瘤坏死因子(TNF)、白介素1(IL-1)或IL-6等,该类细胞因子通过免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)蛋白介导的SYK信号通路参与破骨细胞的活化,并且能够通过下调OPG的表达,上调RANKL的表达,以此来增强破骨细胞功能,并抑制成骨细胞功能[32］。全身炎症反应同样能够激活RANKL,激活的RANKL与破骨细胞表面的核因子κB受体活化因子(RANK)结合,进而激活破骨细胞。在RANK和RANKL相互作用下,最终导致骨质疏松症的发生。此外,文献报道RNA测序结果提示在结肠炎的微炎症环境刺激下,骨髓间充质干细胞中的Wnt信号传导下调,导致结肠炎小鼠的骨髓间充质干细胞在微炎症环境下倾向于分化为脂肪细胞而不是成骨细胞,因此可以通过外泌体的骨靶向药物作用缓解炎症性肠病中的成骨细胞损失和骨质流失[33］。目前,间充质干细胞/基质细胞疗法已成为治疗炎症性肠病的新兴治疗方式,主要是通过分泌抗炎物质、改善微环境以及免疫调节来治疗炎症性肠病,或许间充质干细胞/基质细胞疗法能成为预防炎症性肠病导致的骨质疏松性骨折的重要治疗手段,这仍需要进一步研究。

本研究中的IVW法结果表明,克罗恩病和溃疡性结肠炎是骨质疏松性骨折的高危因素,考虑到遗传变异的作用时间长,作用效果稳定,因此可以把骨质疏松性骨折列为炎症性肠病的潜在并发症之一。近年来,炎症性肠病在我国发病率呈显著上升的趋势,且克罗恩病的发病人群多见于青少年,因此有必要在炎症性肠病患者中进行骨质疏松指标的筛查,若诊断为骨质疏松症,应及时及早行抗骨质疏松治疗,防止骨质疏松性骨折的发生。但本次研究也存在局限性:① 本研究纳入的GWAS数据为欧洲族裔,后续还需要在东亚人及其他族裔中进行孟德尔随机化分析;② 纳入数据缺少具体国家、地域及性别、年龄等,未能进行分层分析,研究结果可能存在偏倚。