ONECUT2高表达介导胃癌复发患者5-FU化疗耐药

朱海峰, 陈述, 龙卫国, 王旭

(江苏大学附属医院1. 化疗科, 2. 肝胆外科, 3. 病理科, 4. 放疗科, 江苏 镇江 212001)

据2020年国际癌症研究机构发布的癌症统计报告,胃癌居全球癌症发病率的第四位[1］。然而目前在胃癌的治疗方面,国际上仍没有统一的标准[2］。在癌症发展的早期,手术切除相对于化疗来说是一种主流的治疗手段,同时大量的化学小分子药物也已经在胃癌治疗领域被广泛应用,包括单一化疗和联合用药等[3-4］。此外,手术前或手术后采用化疗对患者的总生存期及无病生存期都有较好的效果。然而许多胃癌患者会对目前所用的化疗药物产生明显的耐药性,因此进一步探索胃癌耐药新的分子机制与治疗靶点迫在眉睫。

Jacquemin等[5］于1999年首次报道了One cut结构域家族成员2(ONECUT2)。作为ONECUT转录因子家族成员之一,ONECUT2蛋白通过两个DNA结合结构域(一个Homeobox结构域和一个Cut结构域)与特定的DNA序列结合进而调控多个靶基因的转录。近年来研究表明,ONECUT2在前列腺癌、肺癌和胃癌中均出现表达上调,且ONECUT2高表达与肿瘤细胞的增殖、转移及干性相关[6-9］。Chen等[10］报道ONECUT2在胃癌中表达上调且与不良预后等临床病理指标相关,这提示ONECUT2可能是胃癌潜在的治疗靶点。此外,Shen等[6］发现ONECUT2可被化疗诱导的miRNA靶向调控,对乳腺癌细胞的干性亦起到重编程的作用。然而,ONECUT2在复发胃癌的治疗中发挥怎样的作用仍需要进一步探究。

本研究拟利用癌症基因组图谱(TCGA)数据库,分析ONECUT2的表达与胃癌患者的无病间隔期(disease-free interval,DFI)之间的关系,利用基因集富集分析(GSEA)方法寻找ONECUT2潜在影响的信号通路。并且在细胞水平和临床研究方面,探究ONECUT2在胃癌中作为治疗靶点的可行性。

1 材料与方法

1.1 胃癌组织标本来源与收集方法

30例胃癌组织均来自江苏大学附属医院普外科,所有组织均为专业病理科医师选取。本研究符合江苏大学附属医院的伦理委员会相关规定(伦理编号:KY2021K0901),所有标本提供者均签署知情同意书。纳入标准:① 经组织病理学证实为胃腺癌;② 手术方式为胃癌根治术;③ 胃镜病理确诊为复发;④ 具有完整的临床病史资料。排除标准:① 除胃癌外,患有其他原发恶性肿瘤;② 合并严重感染、自身免疫性疾病等并发症无法耐受化疗患者。检测患者ONECUT2表达所用组织为手术切除的胃癌组织,采集时立即取1 cm3大小并加入Trizol充分研磨,置于-80 ℃冰箱长期保存。

1.2 TCGA数据分析

TCGA胃癌患者的ONECUT2表达数据和对应的临床信息均从UCSC Xena网站下载[11］。为了鉴定在胃癌中有意义的指标,胃癌患者根据ONECUT2表达水平的中位值分为高表达(High)和低表达(Low)两组。化疗信息下载自TCGA网站的GDC数据集。RNA测序的数据以Log2(归一化计数+1)表示。

1.3 GSEA分析

GSEA分析使用的数据下载自UCSC Xena网站。将来自TCGA数据库的100个原位胃腺癌患者基因表达数据按照ONECUT2表达高低分为最高表达50组和最低表达50组。GSEA分析使用的是Windows 10系统的GSEA_4.1.0版本。错误发现率(FDR)设置为0.25,P值设置为0.05。

1.4 细胞培养与稳转细胞株建立

人正常胃黏膜上皮细胞(GES-1)和7株人胃癌细胞系AGS、BGC823、HGC27、MGC803、MKN28、MKN45以及SGC7901均购自中国科学院上海生命研究所。293T细胞为本实验室保存。所有细胞均使用含10%胎牛血清以及1%青霉素-链霉素的DMEM培养基培养,细胞培养在含5% CO2的37 ℃培养箱中。sh-ONECUT2和oe-ONECUT2病毒均购自上海吉玛生物有限公司。sh-ONECUT2序列:sh-1,5′-CCGGAGCTGACAATGGAAA-3′;sh-2,5′-GCCAG-CTGGAAGAAATCAA-3′。将ONECUT2敲低的细胞分为sh-Ctrl组、sh-ONECUT2-1组和sh-ONECUT2-2组。将ONECUT2过表达的细胞分为oe-Ctrl组和oe-ONECUT2组。细胞以60%～70%密度接种并感染病毒48 h。稳转株细胞培养在含1 μg/mL的嘌呤霉素培养基中。

1.5 RNA提取与qPCR

细胞或组织的总RNA提取使用Trizol(日本TaKaRa公司)按照说明书完成。逆转录PCR使用PrimeScript RT-PCR kit(日本TaKaRa公司)按照说明书完成。qPCR使用SYBR预混液(日本TaKaRa公司)在Viia7实时定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)上按照常规的循环体系完成:95 ℃ 5 min;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,循环40次。相对mRNA表达量使用2-ΔΔCt进行分析,使用RPS18 mRNA作为内参进行标准化。引物序列:ONECUT2上游5′-GGAATCCAAAACCGTGGAGTAA-3′,下游5′-CTCT-TTGCGTTTGCACGCTG-3′;RPS18上游5′-GCGGCGGAAAATAGCCTTTG-3′,下游5′-GATCACACGTTCCACCTCATC-3′。

1.6 细胞毒性实验

细胞毒性实验使用CCK-8试剂(日本Dojindo公司)完成。细胞以10 000个/孔的密度接种在96孔板中培养过夜,然后更换含有不同浓度5-FU的培养基培养72 h。每孔细胞更换含10% CCK-8试剂的培养基在37 ℃孵育1 h。最后使用多功能酶标仪(BIO-TEK,美国安捷伦公司)检测D(450 nm)值,读数作为细胞存活的指标。

1.7 胃癌复发患者5-FU化疗效果评估

对30例胃癌患者手术切除的肿瘤组织进行ONECUT2mRNA测定,在此基础上评估这30例胃癌复发患者对基于5-FU的联合化疗方案的敏感性。复发的患者通过电子计算机断层扫描(CT)确定肿瘤的大小。通过计算每例患者复发后接受化疗前后肿瘤体积大小(Eclipse软件),得出肿瘤体积减少率。计算公式:肿瘤体积减少率(%)=(化疗前肿瘤体积-化疗后肿瘤体积)/化疗前肿瘤体积×100%。

1.8 统计学分析

所有数据均使用GraphPad Prism 7.0分析。ONECUT2在正常胃组织与胃腺癌组织中的表达差异采用独立样本t检验。生存曲线使用Kaplan-Meier法分析并采用Log-rank检验。ONECUT2的表达量与胃癌患者临床信息的相关性采用χ2检验。使用Cox比例风险回归计算风险比(置信区间为95%)。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ONECUT2在胃癌组织中表达上调且与胃癌患者更短的DFI相关

GTEx数据库的174个正常胃组织、TCGA数据库的36个正常胃组织和414个胃腺癌组织表达谱数据下载自UCSC Xena网站。将二者合并分析,结果显示ONECUT2在肿瘤组织中比正常组织表达显著升高(P<0.01),见图1A。基于TCGA数据库,将242个有DFI统计数据的胃癌患者,按照对应的肿瘤组织ONECUT2表达量分为高、低两组,分析ONECUT2与DFI的关系。结果表明更高的ONECUT2表达量和更短的DFI相关(P<0.01),见图1B。

A:正常胃组织和胃腺癌组织中ONECUT2表达水平比较;B:ONECUT2表达与胃癌患者DFI的关系

2.2 ONECUT2高表达的胃癌患者更容易复发

基于TCGA数据库,将359例有复发数据记录的胃癌患者,按照是否复发分为两组,比较ONECUT2的表达量是否有差异。结果显示,复发的103例患者胃癌组织ONECUT2表达量(10.39±0.19)与无复发的256例患者(9.791±0.13)相比显著升高,差异有统计学意义(t=2.56,P<0.01)。

2.3 ONECUT2高表达与外源药物代谢通路相关

基于TCGA数据库,利用GSEA分析各50例ONECUT2最高表达和最低表达的患者转录组测序数据。结果显示,在Hallmarks和KEGG这两个基因集中,异生物质代谢通路以及细胞色素P450药物代谢通路被显著富集。见图2。

图2 GSEA分析与ONECUT2高表达相关的代谢通路

2.4 5-FU药物细胞毒性实验

2.4.1 验证ONECUT2在不同细胞中的表达情况 与正常胃黏膜上皮细胞GSE-1相比,ONECUT2在胃癌细胞中表达均升高(P<0.01)。根据图3A的结果,挑选HGC27细胞进行ONECUT2敲低,MGC803细胞进行ONECUT2过表达。结果显示在HGC27细胞中,与sh-Ctrl组相比,sh-ONECUT2-1和sh-ONECUT2-2组ONECUT2表达明显降低(P<0.05);而在MGC803细胞中,与oe-Ctrl组相比,oe-ONECUT2组ONECUT2表达明显升高(P<0.01),见图3B、C。

A:ONECUT2在不同胃癌细胞中的mRNA表达情况;B:qPCR检测ONECUT2敲低后的相对表达量;C:qPCR检测ONECUT2过表达后的相对表达量;a:P<0.01,与GES-1细胞相比;b:P<0.05,与sh-Ctrl组相比;c:P<0.01,与oe-Ctrl组相比

2.4.2 ONECUT2敲低细胞对5-FU处理更敏感 采用不同浓度的5-FU处理HGC-sh-ONECUT2细胞,结果显示,与sh-Ctrl组相比,sh-ONECUT2-1和sh-ONECTU2-2组细胞的5-FU IC50值显著降低(图4A)。采用不同浓度的5-FU处理MGC803-oe-ONECUT2细胞,结果显示,与oe-Ctrl组相比,oe-ONECUT2组细胞的5-FU IC50值显著升高(图4B)。

A:HGC27细胞;B:MGC803细胞

2.5 ONECUT2高表达的胃癌复发患者对5-FU化疗不敏感

2.5.1 30例复发患者胃癌组织ONECUT2表达量分析 对30例患者手术切除的胃癌组织进行ONECUT2mRNA水平检测,相对表达量>0.5为高ONECUT2组,<0.5为低ONECUT2组。结果显示,高ONECUT2组有19例患者,低ONECUT2组有11例患者。见图5。

图5 30例胃癌组织ONECUT2 mRNA水平

2.5.2 30例复发患者5-FU化疗效果 结果显示,低ONECUT2表达的患者对5-FU化疗更敏感,肿瘤缩小的体积与ONECUT2表达量呈显著负相关(R2=0.694,P<0.01)。相反,高ONECUT2患者对5-FU化疗响应不具有一致性,甚至有些患者肿瘤体积反而增加(R2=0.020,P>0.05)。见图6。

图6 30例患者5-FU化疗效果与ONECUT2水平相关性分析

3 讨论

胃癌是我国发病率较高且预后较差的癌种之一。在胃癌发展的早期,一般首选手术切除[12］。对于不适合手术或已经发现远端转移的患者来说,化疗则是首选治疗方式。然而化疗药物的低响应率仍是一个亟待解决的问题。5-FU作为一线化疗药物,经常以单药化疗或联合治疗的方式应用于难以手术胃癌患者的治疗中。即使已经有很多患者从目前批准使用的化疗方案中获益,但对这些药物产生耐药的分子机制仍不清楚。

ONECUT2在多种癌症中呈现出表达上调的趋势,对肿瘤的发生发展起到多重调节作用[13-15］。但ONECUT2是不是导致患者产生化疗耐药的关键基因仍不清楚。本研究通过分析TCGA数据库发现,ONECUT2在胃癌肿瘤样本中呈现高表达的趋势,且高表达与更短的DFI相关。这说明ONECUT2高表达会显著促进胃癌的进展。除此之外,ONECUT2高表达的患者胃癌复发的概率更高,这提示单一手术切除的治疗方式对于ONECUT2高表达的患者并不是一个最优的选择。因此需要进一步探究ONECUT2在胃癌中的功能及相关的分子机制。

肿瘤细胞可以通过某些癌基因调控细胞色素P450家族酶的表达,不仅可以促进肿瘤细胞对细胞代谢过程中产生的有害物质的分解,降低对细胞的毒性,还可以降解抗肿瘤药物,抑制这些药物引起的细胞生长受限和细胞凋亡[16］,导致细胞产生耐药性。本研究GSEA相关数据表明,ONECUT2高表达与药物代谢通路相关,其中异生物质代谢和细胞色素P450系统是同种和异种物质生物代谢转换的关键通路[17］。ONECUT2可能通过上调这些通路中关键代谢酶的表达来实现细胞对化疗药物的耐受。但ONECUT2是否直接调控细胞色素P450家族酶的表达仍需进一步研究。

细胞毒性实验表明,ONECUT2过表达的胃癌细胞对5-FU产生明显的耐药性。相反,敲低ONECUT2则会使细胞对5-FU的处理更加敏感。同时本研究表明,ONECUT2高表达的胃癌复发患者对5-FU的治疗响应效果差。以上结果提示,ONECUT2表达的上调可能是胃癌细胞产生耐药的原因,并且有可能是通过激活异生物质代谢相关通路来实现的。已有多项研究表明,5-FU和癌基因抑制剂联合使用展现出较好的抗肿瘤效果。基于5-FU的化疗方案与HER-2靶向治疗及PD-1免疫治疗联合使用展现出较好的抗肿瘤效果[18-23］,ONECUT2抑制剂CSRM617有望成为胃癌复发患者5-FU联合治疗的药物之一。

综上所述,ONECUT2在胃癌患者中表达上调,其高表达与异生物质代谢通路呈正相关。ONECUT2高表达促进胃癌细胞对5-FU化疗的耐药性,而敲低ONECUT2则增加胃癌细胞对5-FU化疗的敏感性。ONECUT2高表达降低胃癌复发患者对5-FU治疗效果的响应,而ONECUT2低表达的胃癌复发患者对5-FU治疗效果响应较好。因此靶向ONECUT2有望为胃癌化疗提供新的理论依据。