海藻有机肥对茉莉花产量、品质的影响及分子机制*

陈云喜,蓝雪雯,陈宝如,陆新范,崔学宇@

(1.南宁师范大学 北部湾环境演变与资源利用教育部重点实验室;广西地标作物大数据工程技术研究中心;广西地表过程与智能模拟重点实验室,广西 南宁 530100;2.广西华米现代农业发展有限公司,广西 南宁 530001)

茉莉花[Jasminumsambac(L.)Aiton]是一种具有重要经济价值的常绿矮灌木[1],在我国主要种植于广西、福建、四川等省(区)[2]。如何提高茉莉花的产量和品质是茉莉花研究的核心问题,合理的施肥是解决这一问题的重要手段[3-4]。海藻生物肥料包含大量的植物所需营养元素及有效活性成分,在多种植物中的栽培中用于品质和产量的改良[5-6]。在草莓和火龙果中的研究中表明,合理的利用海藻生物肥对果实营养成分的含量和产量有显著的促进作用[7-8]。在甜樱桃中的研究表明,海藻提取液可以改良甜樱桃的生长状态以及改善果实的品质[5]。在烟草中的研究表明,海藻肥在提高烟草品质的同时对烟草青枯病的防御有积极的效果[9]。在番茄中的研究中发现,海藻肥的喷施可以增加番茄的鲜重,促进光合,同时可以提高番茄的营养成分[10]。此外,海藻肥料对植物非生物胁迫的抗性的提高有积极的影响[11-13]。海藻肥的施用效果已在多种植物进行了研究,但是否影响茉莉花的产量和品质尚未见报道。这里探讨的是海藻肥对茉莉花生长和产量的影响,同时利用GC-MS的方法对茉莉花挥发性有机物进行了测定,还进行了转录组测序,用以明确海藻肥对茉莉花产量、品质的影响及其可能的分子机制,为海藻肥在茉莉花栽培的田间应用提供理论及实践依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用茉莉花品种为横州市主栽品种双瓣茉莉花,茉莉花种植年限为3年,长势均匀,栽培土壤是赤红壤。试验所需海藻肥广州埃瑞卡生物科技有限公司提供。

在茉莉花剪枝后进行第一次施肥处理,15日后进行第2次施肥处理(2021年6月3日第一次处理),7月3日进行试验数据采集和田间取样。试验设置3个处理,分别为对照、海藻肥、高磷复合海藻肥,处理小区行长11m,行宽1m,每个处理3次重复。

叶绿素测定仪为山东普创仪器有限公司生产。

1.2 方法

1.2.1 生理指标测定

叶片厚度测量(10片):选取10片形态大小相似的茉莉花成熟叶片,利用游标卡尺测量10片叶片的整体厚度,每个处理3次重复。

叶绿素含量测定:选取形态大小相似的茉莉花成熟叶片,利用手持叶绿素测定仪进行叶绿素含量测定,每个处理3次重复。

花枝重量测定(10枝):花芽下剪取5 cm花枝,10枝总重为一组,称取重量,每个处理3次重复。

花枝茎粗测定:花芽下剪取5 cm花枝,利用游标卡尺测定其茎粗,每个处理3次重复。

百蕾鲜重测定:测定百蕾鲜重(含苞待放、花筒伸长、外观饱满),每个处理3次重复。

总产量测定:每个处理选择2 m2的小区,对花蕾进行采摘,连续采摘2日,计算总产量,每个处理3次重复。

1.2.2 转录组测序/挥发性代谢物测试

表1 实时定量 PCR 引物序列

采集将要开放的新鲜花蕾和叶片,液氮速冻,干冰邮寄至武汉迈特维尔生物科技有限公司完成测试。

1.2.3 实时定量PCR测试

结合田间生理数据和转录组表达结果,挑选9个光合相关基因设计引物,在叶片中进行实时定量PCR分析,分析选取Actin基因作为内参,测试委托北京百迈客生物科技有限公司完成。

2 结果与分析

2.1 海藻肥处理对茉莉花生理指标的影响

不同处理对茉莉花的生理指标影响见表2。叶片厚、花枝重和产量这3个性状,均为高磷海藻肥处理>海藻肥处理>对照;两种施肥处理均提高了茉莉花的百蕾重,但两种施肥处理之间没有显著差异;叶绿素含量和花枝粗则表现为高磷海藻肥处理最高,海藻肥处理和对照没有显著差异。

表2 海藻肥处理对茉莉花生理指标的影响

2.2 海藻肥处理对茉莉花挥发性代谢物的影响

利用GC-MS的方法在茉莉花中分离到14大类108种挥发性代谢物,包括19种萜类、17种酯、15种杂环类化合物、13种烃类、9种酮、9种醇、7种芳烃、5种卤代烃、5种醛、3种含硫化合物、2种酸、2种含氮化合物、1种酚和1种胺。代谢物及样本均聚类结果如图1所示。由图1看出,相同处理的组别被聚类到同一组中。

利用Fold Change、OPLS-DA模型的VIP值相结合的方法对不同处理的茉莉花差异代谢物进行筛选,结果见表3。由表可知,与对照相比,施肥处理后均有部分代谢物显著下调。其中海藻肥和对照处理相比,显著下调的挥发性代谢物有6种,包括4种酯、1种酸和1种芳烃,这6种挥发性代谢物分别为:十八烯酸甲酯(Methyl stearate)、3-甲基-6-苯基-4-(1-苯基乙氧基)-1-己烯(3-methyl-6-phenyl-4-(1-phenylethoxy)-1-Hexene)、(Z)-十六烷基十一烯基乙酸酯(11-Hexadecen-1-ol,acetate,(Z)-)、十六酸甲酯(Hexadecanoic acid,methyl ester)、十七烷酸(Heptadecanoic Acid)和2-糠酸己酯(2-Furancarboxylic acid,hexyl ester);高磷海藻肥和对照相比,显著下调的挥发性代谢物是十八烯酸甲酯;高磷海藻肥和海藻肥处理相比,显著上调的挥发性代谢物有4种,包括2种酸和2种酯,这6种挥发性代谢物分别为(Z)-十六烷基十一烯基乙酸酯、十六酸甲酯、十七烷酸和(E)-3,7-二甲基-2,6-辛二酸(2,6-Octadienoic Acid,3,7-dimethyl-,(E)-)。

表3 差异代谢物数量统计

2.3 不同处理茉莉花叶片转录组的差异分析

测序过滤后得到63.32G的clean data,组装获得93173条基因,基因的平均长度为1140 bp,利用主成分分析对不同处理后茉莉花的变量内部结构进行分析,PCA结果如图2所示。由图可知,相同处理的茉莉花相对聚集。

图2 PCA 图

对不同组间差异基因进行筛选,差异基因的筛选条件为 |log2Fold Change|>=1,且符合用Benjamini-Hochberg方法对假设检验概率(P value)进行多重假设检验校正后错误发现率(FDR)<0.05。对差异基因的统计见表4,不同组别之间差异基因的重叠情况如图3所示。

图3 差异表达基因的维恩图

图4 差异基因 KEGG 富集分析(对照和海藻肥处理)

图5 差异基因 KEGG 富集分析(对照和高磷海藻肥处理) 图6 差异基因 KEGG 富集分析(高磷海藻肥和海藻肥处理)

图7 光合相关基因的表达分析

表4 差异表达基因数量统计

对差异基因进行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)注释,合计128个代谢通路被注释,注释后对其进行显著性富集分析,富集最显著的20条pathway如图所示,对照和海藻肥处理、高磷海藻肥相比,有10条显著富集的代谢通路相同,主要包括:色氨酸代谢(Tryptophan metabolism)、植物中的MAPK信号途径(MAPK signaling pathway-plant)、丁酸代谢(Butanoate metabolism)、脂肪酸降解(Fatty acid degradation)、α-亚麻酸代谢(alpha-Linolenic acid metabolism)、酮体的合成与降解(Synthesis and degradation of ketone bodies)、氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation)、甘油磷脂代谢(Glycerophospholipid metabolism)、单环菌素生物合成(monobactam biosynthesis)等;高磷海藻肥和对照、海藻肥处理相比,有7条显著富集的代谢通路相同,主要包括:磷酸戊糖途径/糖醛酸途径(Pentose and glucuronate interconversions)、光合作用(Photosynthesis)、吲哚生物碱生物合成(Indole alkaloid biosynthesis)、半乳糖代谢(Galactose metabolism)、RNA聚合酶(RNA polymerase)。

2.4 海藻肥处理对光合作用相关基因的影响

对转录组结果进行分析发现,海藻肥和对照相比,捕光复合体Ⅱ叶绿素 a/b 结合蛋白基因Lhca1、Lhcb1基因表达下降,Lhca4、Lhca2基因表达上升,光系统相关基因Psa L基因表达上升。高磷海藻肥和对照相比,提高了捕光复合体Ⅱ叶绿素 a/b 结合蛋白基因Lhca1、Lhca4、Lhcb6基因的表达,同时提高了光系统相关基因Psb Q、Psa E、Psa N、Psa L基因的表达;高磷海藻肥和海藻肥处理相比提高了捕光复合体Ⅱ叶绿素 a/b 结合蛋白基因Lhca1、Lhca4、Lhcb1、Lhcb4、Lhcb6的表达,同时提高了光系统相关基因Psb Q、Psa E、Psa F、Psa G、Psa L基因的表达,对相关基因进行实时定量PCR验证,验证结果表明和转录组测序结果趋势一致,转录组结果真实可靠,证明施肥处理后对光合相关基因表达有促进的作用。

3 讨 论

随着技术的发展,检测代谢物已是验证作物品质差异的有效方法[14-15]。前人对广西横县11个样点茉莉花挥发组分的GC-MS检测到242个已知的香气组分,本研究在不同海藻肥处理的茉莉花样本中分离到14大类108种挥发性代谢物,将这些组分和前人的11个样点中香气组分含量前50的化合物相比,有15个化合物在本研究中检测出来,产生结果差异可能是数据库之间的差异。香气是茉莉花品质的重要评判指标[16-17],花香在茉莉花生长的过程中容易受到外界因素的影响[18-19]。前人利用HS-SPME/GC-MS的方法在32个茉莉花鲜花样本中获得了29种特征性挥发物,这些挥发性化合物占茉莉花茶挥发物含量的95%以上[20]。在本研究中2个施肥处理组和对照相比,十八烯酸甲酯的含量均下降,此外有5种挥发性物质在仅施海藻肥组和对照组之间含量有差异,但是这些差异物质没有包含在前人研究的茉莉花特征挥发物质之中,说明海藻肥处理后,由于产量的提高,茉莉花品质可能发生了有限度的下降,磷肥对这种品质的下降有一定的补偿作用。

本研究发现,海藻肥和高磷海藻肥处理后,增加了茉莉花的叶片厚度、花枝重量、花枝茎粗、百蕾鲜重,提高了茉莉花的叶绿素含量和茉莉花的产量。在茉莉花平衡施肥的研究中表明,茉莉花的产量和磷肥施用成正相关,合理施肥是茉莉花高产优质的关键因素。本研究中,海藻肥施用可以提高茉莉花的产量,在海藻肥施用的基础上增加磷肥的施用可以更高的提高茉莉花的产量,磷肥的施用可能是茉莉花高产的关键因子之一。随着技术的发展,高通量测序技术可以揭示作物产量、品质变化的分子机制[21-24]。本研究中,不同组别之间合计128个代谢通路被富集,对显著富集的代谢通路进行分析发现,大多数显著富集的代谢通路与物质代谢相关,高磷海藻肥和对照、海藻肥处理相比,光合作用这一代谢通路均被显著富集。前人在茶用菊中的研究表明,光合速率和叶绿素含量和产量极显著正相关[25],本研究同样证明施肥处理后,茉莉花产量的提高可能是施肥处理可以提高茉莉花叶绿素的含量,同时提高了光合相关基因的表达。

4 结论

利用田间测试、GC-MS和转录组测序的手段对海藻肥、高磷海藻肥处理后茉莉花产量品质的变化进行了研究,结果表明,高磷海藻肥处理后,增加了茉莉花的叶片厚度、花枝重量、花枝茎粗、百蕾鲜重,提高了茉莉花的叶绿素含量和产量;施肥处理后,部分挥发性代谢物表达下调,磷的施用可以减少下调代谢物的数量;施肥处理促进了叶片光合相关基因的表达可能是茉莉花产量提高的原因。