阿司匹林抑制胃癌干细胞的机制研究*

王子昂,马洪杰,王腾飞,武 倩,周 红,宁志丰,沈 昕,吴 喆,

(1.湖北科技学院医学部临床医学院,湖北 咸宁 437100;2.湖北科技学院医学部公共卫生及健康学院;3.湖北科技学院医学部基础医学院;4.湖北科技学院医学部口腔与眼视光学院)

胃癌(gastric cancer,GC)是全球常见的恶性肿瘤疾病,据国际癌症研究机构报告的全球癌症患病现状调查显示,2012年中国GC发病数占全球GC发病数的42.6%,其死亡率45.0%居第六位[1]。近年来研究表明[2-3],非甾体抗炎药(non-steroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs)可以有效干预肿瘤细胞信号转导、诱导肿瘤细胞凋亡,对胃癌具有潜在的预防和治疗效果。阿司匹林是非甾体抗炎药的代表性药物,几十年来临床上广泛用于治疗风湿和类风湿、心血管等疾病。阿司匹林有抗肿瘤增殖和诱导肿瘤细胞凋亡的作用[4],长期服用阿司匹林可以显著降低胃癌的死亡率[5]。本研究以人胃癌细胞株SGC7901为研究对象,探讨阿司匹林对胃癌干细胞有无抑制作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人胃癌细胞株SGC7901购自中国典型培养物保藏中心,RPMI1640培养基、DMEM/F12培养基、胎牛血清购自Gibco公司,双抗购买自碧云天生物技术公司,Transwell小室购买自Costar公司,低黏附6孔板以及96孔板购自Corning公司,Matrigel基质胶购买自BD公司。人表皮生长因子EGF、人碱性成纤维细胞生长因子bFGF、神经生长因子B27、阿司匹林(批号:A2093)、MTT(批号:M2128)、二甲基亚砜(DMSO)(批号:472301)购自SIGMA公司。天逸510S-07ICB型酶标仪购自美国Bio-Tek公司、BCA蛋白定量检测试剂盒(批号:KGPBCA)、蛋白提取试剂盒(批号:KGP1050)和SDS-PAGE凝胶试剂盒(批号:KGP113K)均购自南京凯基生物。EPS600型电泳仪购自美国Bio-Rad公司,TH4-200型倒置显微镜购自日本Olympus公司。其他试剂为生化分析纯。

A.不同浓度阿司匹林对胃癌SGC7901细胞48h增殖的影响;B.不同时间段阿司匹林(0.4mmol/L)对胃癌SGC7901细胞增殖影响(与空白对照相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,n=3)。

A.不同浓度的阿司匹林对胃癌SGC7901细胞的克隆形成图;B.不同浓度阿司匹林对胃癌SGC7901细胞的克隆数统计图(与空白对照组比较,**P<0.01,n=3)。

A.不同浓度的阿司匹林对胃癌SGC7901细胞纵向迁移情况与纵向迁移能力统计图;B.不同浓度的阿司匹林对胃癌SGC7901细胞侵袭能力与侵袭能力统计图(与空白对照组比,***P<0.001,n=3)。

A.经不同浓度阿司匹林干预24h后相关蛋白的表达情况;B.E2F1灰度值统计结果;C.Sox2灰度值统计结果(与对照组比较,***P<0.001,n=3)。

1.2 实验方法

将胃癌细胞株SGC7901细胞在普通完全培养基(10%的FBS、90% RPMI-1640、1%的青霉素链霉素双抗)于37℃、5% CO2培养箱内培养,待培养约48h后换液1次;待贴壁细胞铺满培养瓶约80%时,以0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化,将细胞吹打分离,离心重悬后以1∶2比例进行传代。

1.2.2 阿司匹林药物浓度的配制

称取1800mg阿司匹林溶于2.5mL DMSO,制成4mol/L的阿司匹林原液,按照实验要求用培养基稀释成实验所需的浓度梯度:0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mmol/L。

1.2.3 微球体的培养

取处于对数生长期的SGC7901细胞,用PBS洗掉残留的血清。用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化,1000转5min离心、计数、悬浮培养基重悬、取10 000个细胞接种于Poly-hema包被的25cm的2个培养瓶中,放于37℃、5% CO2、恒温恒湿的细胞培养箱内培养,24h后加入悬浮培养基2mL。悬浮培养基的组成为:无血清DMEM/F12(1∶1)中添加20ng/mL EGF、10ng/mL bFGF、2% B27,2d半左右培养液颜色变为微黄时半量换液。取生长至10d左右的微球体开展后续试验。

1.2.4 MTT法

取悬浮培养的微球体,离心,经胰酶消化吹打成单细胞,细胞计数,放入普通培养基重悬,调整细胞密度至1×106/mL。将微球体细胞接种于96孔板中,培养24h,将96孔板中的原培养液弃去,用PBS洗两遍,每个浓度设3个复孔,边缘孔用无菌PBS充填即(空白对照)和只加入普通完全培养基不加药(调零孔)以及(实验组)即各孔以0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mmol/L阿司匹林填充,定容至200μL,放于培养箱中培养,在终止培养前4h,每孔加入20μL MTT,3～4h后,小心吸去原培养液,每孔加入150μL DMSO,37℃温箱孵育10min,随后用酶标仪检测490nm处各孔的吸光度(A)值。药物抑制率为(1-实验组OD/对照组OD)×100%。

1.2.5 平板克隆形成实验

第四，加强水利财务工作，是深化水利重点领域改革、创新水利科学发展体制机制的迫切需要。改革创新是水利事业发展的引擎和动力。当前，水利改革已经进入攻坚阶段，深层次矛盾日益显现，推进难度不断加大。必须从水利改革发展全局出发，抓住重点，突破难点，力求在建立水利投入稳定增长机制、推进水价综合改革上取得新进展，同时，积极协调落实好现有政策，着力稳定管理经费渠道和规模，为水资源管理、水利工程管理、基层水利服务体系建设等提供强有力的资金保障。

取处于悬浮培养的微球体,胰酶消化后,离心重悬,细胞计数,加入6孔板中,每孔约接种1000个微球体细胞,隔天换液,加入阿司匹林浓度梯度为0、0.2、0.8mmol/L的完全培养基,每个浓度设3个复孔,3～4d换液一次,10～14d镜下观察,克隆形成后终止培养,将原培养液弃去,PBS洗2遍,1mL甲醇室温固定30min,每孔1mL 0.1%结晶紫染色30min,细流水冲洗,干燥后拍照,计算阳性克隆数。克隆率为克隆数/接种细胞数×100%。

1.2.6 Transwell小室侵袭实验

将保存于-20℃的matrgel基质胶预先4℃环境下解冻,成液态后与无血清培养基按1∶5的比例混匀,每小室加入100μL放于37℃、5% CO2培养箱,3～4h后至其完全凝固备用,使用前用无血清培养基润湿。取微球体,胰酶消化、离心、吹打其至均匀,用无血清培养基将其重悬、计数,每小室接种20 000个微球体细胞,加入阿司匹林(浓度为0、0.2、0.8mmol/L),下室加入500μL含20%FBS的普通培养基,每一浓度梯度设3个复孔。24h后在37℃、5% CO2培养箱内取出小室,PBS洗3遍,每孔加入4℃预冷的甲醇固定30min,用0.1%结晶紫染色,吸出结晶紫并用超纯水清洗2遍,室温风干,拍照。每小室取3个角度进行拍摄,计数。

1.2.7 Transwell小室迁移实验

收集悬浮培养的微球体细胞,胰酶消化,离心,将其吹打均匀,计数,无血清培养基重悬,每一小室加入20 000个细胞,阿司匹林浓度梯度为0、0.2、0.4、0.8mmol/L,且上室每孔最终总体积为200μL,设3个复孔,放置细胞孵箱培养17h取出小室,PBS洗两遍,用0.1%结晶紫染色20min,清洗风干,于镜下观察记录膜背面迁移的细胞数,每小室取3个角度进行拍摄计数。

1.2.8 Western blot法检测Sox2和E2F1的蛋白表达情况

RIPA强裂解液提取微球体细胞总蛋白。BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度,以每孔15μg蛋白量上样进行SDS-PAGE凝胶电泳。将凝胶中蛋白转移到PVDF膜,5%脱脂奶粉室温封闭2h,PBS-T将兔抗人E2F1单克隆抗体(1∶1000,Abclonal,产品编号:A19579)、兔抗人Sox2单克隆抗体(1∶1000,Abclonal,产品编号:A19118)进行稀释,4℃孵育PVDF膜过夜,次日PBS-T洗膜,用抗体稀释液(碧云天)稀释相应的HRP标记二抗(1∶10 000),37℃摇床孵育1h。用TBST充分洗涤PVDF膜4～5次,每次5min,滴加ECL工作液于PVDF膜上,充分反应数分钟待荧光条带明显后,冲洗胶片,显影。重复实验3次。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0统计软件进行分析,计量资料以卡方检验表示,多组间比较采用单因素方差分析,检验水准α=0.05(双侧),当P<0.05则认为具有统计学差异。

2 结 果

2.1 阿司匹林抑制了胃癌SGC7901微球体细胞的增殖

阿司匹林作用48h后对人胃癌细胞株SGC7901的增殖具有抑制作用,其抑制程度随阿司匹林浓度的增加而增强,呈现剂量依赖性(图1A)。随着时间的推移,0.4mmol/L阿司匹林呈时间依赖性抑制人胃癌细胞株SGC7901的增殖(图1B)。

2.2 阿司匹林抑制了胃癌SGC7901微球体细胞的克隆形成能力

与一定浓度梯度的阿司匹林(0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mmol/L)孵育后,抑制了SGC7901微球体细胞的克隆形成能力呈剂量依赖性(P=0.0035),如图2。

2.3 阿司匹林抑制了胃癌SGC7901微球体细胞的迁移和侵袭能力

我们发现,与一定浓度梯度的阿司匹林(0、0.2、0.8mmol/L)孵育后,抑制了SGC7901微球体细胞的纵向迁移和侵袭能力,呈浓度依赖性(P均<0.001)。如图3。

2.4 阿司匹林抑制了胃癌SGC7901微球体细胞E2F1和Sox2的蛋白表达

为了验证阿司匹林对E2F1和Sox2蛋白表达的影响,我们从经阿司匹林孵育后的微球体中提取总蛋白,实施了western blot,发现阿司匹林剂量依赖性(0、0.2、0.8mmol/L)下调了胃癌SGC7901微球体细胞E2F1和Sox2的蛋白表达,说明阿司匹林通过下调干性相关基因抑制了胃癌干细胞(P<0.001),如图4。

3 讨 论

胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,也是导致恶性肿瘤患者死亡的第三大原因[6]。据资料显示[7],胃癌的发生、发展、转移、扩散与胃癌干细胞有较为密切的关系,而干细胞是一类具有自我更新和增殖分化能力的细胞。Okumura等[8]研究表明,在人胃癌细胞株中存在具有干细胞特性的胃癌细胞,且这些细胞在体外无血清培养基中培养,可形成球形的细胞集落,该集落具有干细胞样特性。阿司匹林即NSAIDs类药物,具有解热、镇痛、抗炎、抗血栓等药理作用。阿司匹林作为老药新用的代表,是应用最为广泛的药物之一。近年来,根据流行病学调查显示[9],常规服用非甾体抗炎药(NSAIDS)可降低结肠癌发病风险。即非甾体抗炎药对胃肠道类的肿瘤疾病具有潜在的防治效果。Moon等[10]研究表明,阿司匹林可通过抑制Cox-2/PTGS2信号通路,激活体内r受体(r-PPAR)的表达,改善抗肿瘤药物的耐药性,对结肠癌干细胞的自我更新起抑制作用。Sox2基因是最基本的干细胞基因之一,其编码的Sox2蛋白具有维系胚胎干细胞的重要作用以及调节细胞自我更新能力[11]。E2F1即肿瘤相关因子,转录因子E2F1是E2F家族重要成员之一,它为细胞周期的重要调控因子,可使G1期向S期转变[12]。有资料表明[13],E2F1基因在胃部组织中的表达可能与胃癌的发生、发展有关,但其蛋白表达与各类临床病理变化间不存在必要联系[14]。本实验通过采用人胃癌细胞株SGC7901在仅含上皮生长因子(EGF)和基本成纤维细胞生长因子(bFGF)的无血清培养基中培养为具有胃癌干细胞特性的微球体,探讨不同浓度阿司匹林对人胃癌细胞株SGC7901微球体的细胞侵袭及迁移的影响。结果表明,高浓度阿司匹林对肿瘤细胞迁移和侵袭具有抑制作用,且呈剂量相关性。空白组与对照组相比,人胃癌细胞株SGC7901细胞微球体采用阿司匹林作用后,E2F1和Sox2蛋白的表达量均有下降,并且E2F1和Sox2基因均作为肿瘤组织中促肿瘤组织发生、增长的一小部分。由此,可以将E2F1和Sox2蛋白作为胃癌治疗中的靶点。