3D生物打印前列腺癌模型用于唑来膦酸药敏试验*

王晗，朱莲，唐靓，杨亚冬，赵思雨，张文元

（杭州医学院 1.公共卫生学院；2.基础医学与法医学院；3.检验医学院、生物工程学院，浙江 杭州 310013 ）

前列腺癌是老年男性常见疾病，正严重影响着我国男性患者的健康，寻求精准的药物治疗很重要［1］。目前，超过90%的潜在抗癌药物在临床试验中失败，主要原因是目前用于药物开发和个性化治疗的临床前模型不准确［2］，使用了过于简化的体外模型，缺乏对肿瘤微环境的模拟。虽然2D 培养系统仍然是良好的高通量基础研究的选择，但它忽视了细胞自然的3D 微环境，难以达到高水平的生物学复杂性［3］。因而很有可能会提供治疗效果的不准确信息，使得假阳性化合物进入临床试验。在2D 培养条件下筛选为有效药物，而临床应用往往无效［4］，导致高退出率，浪费时间和金钱。体内模型虽然更能反应肿瘤的发生和行为机制以及药物代谢，但是这些模型使用和维护更加昂贵，费时费力，同时涉及伦理问题。由于2D 培养的局限性和体内模型的复杂性，刺激了体外三维肿瘤模型的开发［5］。3D 细胞培养可克服2D培养的限制，提高诊疗效果［6］，正在成为药物研究中有力的新型手段，成为介于二维培养和动物实验之间的一种折中方法［7］，以弥合两者之间的鸿沟［8-9］，可提高对生理或病理过程、药物发现和筛选的认识［10］。从而提高临床前药物研究的预测能力，改善药物临床转化［11］。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）中的人基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2,MMP-2）、人基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9,MMP-9）降解Ⅳ型胶原，在肿瘤细胞的侵袭与转移灶的形成中起重要作用［12］。为了改善晚期前列腺癌和骨骼受累患者的预后，需要更好地了解这一过程是如何启动和调节的。本实验采用ELISA法测定细胞培养上清液中MMP-2、MMP-9 蛋白表达含量变化，可更全面地捕捉前列腺癌侵袭与转移的生物学特征及机制［13］。

3D 生物打印技术为建立模拟异质肿瘤微环境模型提供了可能性，可以精确定位包括水凝胶、细胞和营养物质在内的生物墨水，以创建3D 体外培养环境［14］。临床上前列腺癌患者常采取手术治疗及放疗、化疗［15］。唑来膦酸是临床上被广泛应用的化疗药物［16］。本实验采用唑来膦酸作为药敏试验药物。本实验通过3D 生物打印技术构建前列腺癌PC-3 细胞3D 模型，并进行唑来膦酸药敏试验，并与2D 细胞培养进行比较，利用ELISA 法测定培养上清液中MMP-2、MMP-9 蛋白表达含量变化。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

前列腺癌PC-3 细胞（赛百慷）；RPMI-1640培养基（Gibco）；胎牛血清（Procell）；海藻酸钠（Sigma），明胶（Sigma），钙黄绿素-AM（Solarbio），碘化丙啶（Solarbio）。唑来膦酸（Macklin），先用少量完全培养基溶解，并用0.22 μm 滤膜过滤后，再用完全培养基配置为工作浓度。人基质MMP-2、MMP-9 两种ELISA 试剂盒（晶美生物工程有限公司）；3D 生物打印机（BioScaffolder2.1，德国GESIM 公司）；荧光倒置显微镜、多功能酶标仪（上海普丹光学仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 前列腺癌细胞于2D 培养下药敏试验 前列腺癌PC-3 细胞使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养，每2～3 d 换液1 次，0.25%胰蛋白酶消化传代。收集对数期生长的PC-3 细胞，制成5×104cells/mL 细胞悬液，100 μL/孔均匀接种于96 孔板。37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h 后，弃上清，分别加入不同浓度的唑来膦酸（25、50、100 μmol/L），100 μL/孔，每个浓度设3 个复孔。继续培养48 h 后，每孔滴加10 μL CCK-8 溶液，继续培养4 h，酶标仪测定450 nm 处OD 值。细胞存活率=（加药处理OD 值/未加药处理OD 值）×100%。

1.2.2 3D 生物打印构建前列腺癌模型 将1.2 g明胶粉末、1.6 g 海藻酸钠粉末分别溶于10 mL 0.9% NaCl 溶液中。每天70 ℃、30 min 水浴1 次，连续3 d，对两种溶液进行灭菌。将PC-3 细胞制成1×106cells/mL 细胞悬液，与明胶溶液和海藻酸钠溶液以1∶2∶2 的体积比均匀混合为前列腺癌细胞/水凝胶，装入无菌打印筒，2 000 r/min 离心2 min 消除气泡，37 ℃水浴加热5 min，连接内径0.17 mm 的打印枪头，安装到3D 生物打印机上。打印内部结构为网格状的结构体，为10 mm×10 mm×0.8 mm。该网状结构体由圆柱状微丝逐层交错堆积形成。料桶温度37 ℃，气压150 kPa，打印速度15 mm/s，无菌操作下挤压制造。将打印好的前列腺癌细胞/水凝胶结构体立即滴加5% CaCl2化学交联5 min，即为3D 前列腺癌模型。PBS 轻轻洗涤2～3 次，放入24 孔板中培养，每孔含1 mL 培养基，隔天换液。

1.2.3 3D 条件下检测PC-3 细胞的药物敏感性上述3D 前列腺癌模型培养1 d 后，弃上清，分别加入不同浓度的唑来膦酸（25、50、100 μmol/L），每个浓度设3 个复孔。继续培养48 h 后，将Live/Dead 双荧光染色剂4 μmol/L 钙黄绿素-AM 和2 μmol/L 碘化丙啶混合并通过0.22 μm 过滤器过滤后，均匀滴加于3D 前列腺癌模型上，于37 ℃黑暗环境下孵育30 min，PBS 洗涤3 次。荧光倒置显微镜分别在488 nm（钙黄绿素-AM 的激发波长）和543 nm（碘化丙啶的激发波长）处进行图像采集。每个样本选择3 个随机位置，同一位置、深度拍摄细胞，绿色为活细胞，红色为死细胞，并合并活/死图像。细胞存活率=（绿色染色细胞数/细胞总数）×100%。

1.2.4 ELISA 试剂盒检测2D/3D 细胞培养上清液中MMP-2 和MMP-9 的蛋白浓度 取对数期PC-3细胞，以2.5×104个/mL 的密度种于24 孔板中，1 mL/孔均匀接种，作为2D 前列腺癌模型。将1.2.2项通过3D 打印技术构建的模型作为3D 前列腺癌模型将上述2D/3D 前列腺癌模型培养24 h 后，弃去原培养基，分别加入不同终浓度唑来膦酸0、5、10、20 μmol/L，加药完毕后，于培养箱中培养36 h。收集细胞上清液3 000 r/min 离心15 min，小心吸取上清液，分装后冻存于-80 ℃。每个浓度均设5 个复孔。按照试剂盒说明书操作，检测上清液中MMP-2 和MMP-9 的蛋白浓度。

1.3 统计学方法

使用GraphPad Prism 进行统计学处理。计量资料以均数±标准差（），两两比较采用配对t检验；P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2D 培养条件下唑来膦酸对前列腺癌细胞增殖的影响

当唑来膦酸浓度25 μmol/L 作用于PC-3 细胞时，细胞受到一定程度的抑制。当浓度50 μmol/L时，细胞出现明显抑制。当浓度100 μmol/L 时，PC-3 细胞大量死亡。见图1 及表1。

表1 2D/3D 培养条件下不同浓度唑来膦酸对PC-3 细胞存活率的影响（n=3,,%）

表1 2D/3D 培养条件下不同浓度唑来膦酸对PC-3 细胞存活率的影响（n=3,,%）

2.2 3D 条件下唑来膦酸对PC-3 细胞生长的影响

图2 表明，不同浓度唑来膦酸对3D 条件下前列腺癌细胞-水凝胶结构体中PC-3 细胞增殖活性，随着药物唑来膦酸浓度的递增，PC-3 活细胞数量逐渐减少，死细胞数量逐渐增多。结果显示当唑来膦酸50 μmol/L 时，PC-3 死亡细胞数量有所增多。当唑来膦酸浓度100 μmol/L 作用时，PC-3 死亡细胞数量明显增多。见图2 及表1。

图2 不同浓度唑来膦酸对3D 培养前列腺癌PC-3 细胞存活的影响（×100）

2.3 2D/3D 条件下唑来膦酸对PC-3 细胞存活率影响的比较

与2D 培养条件下相比，不同浓度的唑来膦酸对3D 培养条件下对PC-3 前列腺癌细胞的整体药物敏感性显著低于2D 培养条件下的药物敏感性。即与2D 培养相比，3D 细胞培养的整体耐药性显著增加。见表1。

2.4 2D/3D 条件下唑来膦酸对PC-3 细胞培养上清液中MMP-2 和MMP-9 蛋白分泌的影响

ELISA 检测结果显示，不同浓度唑来膦酸于2D/3D 条件下作用于PC-3 细胞36 h，均可导致MMP-2 和MMP-9 的分泌减少，并呈剂量依赖关系。与空白0 μmol/L 相比，各浓度组MMP-2 和MMP-9 的分泌减少。3D 培养上清液MMP-2 和MMP-9 蛋白分泌浓度的下降速度均明显慢于2D 培养模型，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 唑来膦酸对PC-3 细胞培养上清液MMP-2、MMP-9 蛋白分泌的影响（n=5,,ng/mL）

表2 唑来膦酸对PC-3 细胞培养上清液MMP-2、MMP-9 蛋白分泌的影响（n=5,,ng/mL）

注：1）与0 μmol/L 相比，P＜0.05；2）与2D 比较，P＜0.05。

3 讨论

尽管在癌症研究和药物发现/开发方面有重大投资，但新癌症药物批准率≤5%，大多数转移性癌症仍然无法治愈。绝大多数的癌症新药在临床开发中失败，因为缺乏治疗效果和/或不可接受的毒性。抗癌药物开发成功率低的主要原因之一是临床前模型未能充分概括人类癌症的复杂性和异质性。在体内测试之前，大多数癌症生物学家仍然依赖传统的2D 单层培养技术，在体外测试抗肿瘤药物［17］。尽管易于处理，2D 培养的结果往往不能有效地转化为体内临床前研究，绝大多数有前景的临床前药物对真正的肿瘤患者无效，从而延误了成功治疗方法的发现。这是因为2D 培养缺乏细胞与细胞、以及细胞与肿瘤微环境的接触，这在肿瘤信号传导和药物反应中很重要，从而导致与真实肿瘤相比恶性表型减少［18］。无论是2D 癌细胞培养，还是动物实验，都难以破解其药物测试的局限性［19］。生物工程的进步尤其令人鼓舞的简单经济的3D 技术快速发展，具体而言，三维培养最近获得了肿瘤和基质细胞模型，在模拟癌症生态位和肿瘤微环境，以及与其之间的相互作用方面显示了巨大的潜力。从这个意义上说，更好地重现体内细胞环境的癌细胞3D 培养成为科学上准确和低成本的癌症模型，用于临床前筛选和测试新药候选药物，然后再转向昂贵和耗时的动物模型［20］。此外，尽管动物模型是临床前研究的关键，但已经实施了更严格的指令，以促进替代生物系统的使用。在此背景下，3D 肿瘤模型的开发和整合到临床前研究工作流程尤其具有吸引力，在减少体内模型数量的同时，促进临床试验治疗学的进步和成功［21］。3D 肿瘤模型弥合了2D 细胞培养模型和体内模型之间的一些差异，其中包括形态、极性、药物渗透性和基因表达。可提高新型治疗药物的预测性能，并为个性化治疗提供机会［22］。

3D 模式下药物可能无法完全穿透3D 系统到达核心附近的癌细胞，与2D 培养系统相比，这些细胞对药物具有更强的抵抗力，往往更好地预测体内药物反应［23］。3D 模型通常显示的药物反应行为比2D 培养更接近实际肿瘤［24］。因此，为癌症研究增加另一个维度既不会取代现有的2D 细胞培养，也不会取代动物试验，但它肯定会有助于提高疗效的可预测性［25-26］。由于化疗药物研发具有高成本和所需时间长的特性，应继续研发更加精准的筛选平台。利用3D 打印机构建的3D 在肿瘤细胞模型，精准性高，可重复连续打印，耗时短且开发成本较为低廉［27］。利用3D 生物打印机构建的肿瘤模型有望成为2D 肿瘤细胞培养和动物实验支架的桥梁。3D 生物打印水凝胶的优势在于能够更为准确地模仿细胞外基质［28］。3D 环境中的前列腺癌细胞埋藏于不同层次的前列腺癌模型中，大部分细胞生长阶段不同，处于3D 条件下的前列腺癌细胞与正常体内癌细胞更为接近［17］。

3D 生物打印水凝胶前列腺癌模型为癌细胞提供了广阔的空间，3D 前列腺癌模型中的肿瘤细胞成多层结构，可使癌细胞持续增长。同时3D 前列腺癌模型充分模拟了细胞外基质与癌细胞之间的通讯功能，并造成细胞缺氧状态，增加了癌细胞增殖时间［21］。与2D 细胞培养评估药物敏感性相比，3D 生物打印技术的使用使研究人员获得更加准确的结果。但当前的3D 打印生物打印仍然受细胞类型和模型设计的限制，需要进一步的工作开发生物材料和打印方法来构建可以更好地模仿动态生化和机械环境的肿瘤模型。

考虑到超过25 μmol/L 唑来膦酸对2D 培养的PC-3 细胞有较大的损伤，所以本实验采用≤20 μmol/L唑来膦酸检测其在2D/3D 条件下对PC-3 细胞培养上清液中MMP-2 和MMP-9 蛋白分泌的影响。实验结果显示，随着唑来膦酸浓度的升高，PC-3 细胞存活率成下降趋势。唑来膦酸的药敏性在2D 和3D 条件下有显著差异，在3D 环境中前列腺癌细胞的存活率显著高于2D 环境。随着唑来膦酸浓度的升高，3D 细胞培养上清液MMP-2 和MMP-9 蛋白分泌的下降速度均明显慢于2D 培养模型。可能是因为3D 培养方法在能够维持细胞生长的前提下，允许细胞与基质之间的相互作用，可能更好地反映了真实的肿瘤微环境，比单层细胞培养更类似于体内生长的形态。

综上所述，使用3D 生物打印技术构建的PC-3 前列腺癌细胞水凝胶结构体（3D 前列腺癌模型）具有比2D 培养更高的耐药性，细胞培养的空间维度及其与基质之间的相互作用对药物的耐药性评估有显著影响。