一种白蜡树真菌病害的分离与鉴定

覃莹菲，张 鑫，陈 岳，李成刚，谭新球

（1.湖南大学研究生院隆平分院，湖南 长沙 410125；2.湖南省农业科学院植物保护研究所，湖南 长沙 410125）

白蜡树（Fraxinus chinensisRoxb）为木犀科梣属大型落叶乔木[1]，在我国共有27 种。白蜡树高15～20 m，树皮呈灰褐色，顶生的小叶与侧生的小叶等大或稍大，羽状复叶长15～25 cm，叶柄长4～6 cm。白蜡树耐旱，萌发能力强，生长迅速，树形优美，材理通直，还有较强的耐盐性，常种植于盐碱地以改良环境，具有较好的绿化及生态价值[2]。白蜡树在我国种植历史悠久、分布甚广，其植株生长迅速，枝条柔韧可供编制各种用具，树皮还具有较高的药用价值[3]，相关产业具有一定规模。

近年来，白蜡树病虫害问题日益严重，在树苗期和成熟期对白蜡树造成严重危害，阻碍白蜡树生长发育及相关产业发展。研究报道，由立枯丝核菌引起的立枯病是白蜡树苗期的主要病害，主要危害地下根部和茎基部，导致白蜡树出现不规则褐色凹陷的病斑，严重时会导致幼苗死亡[4]。白蜡褐斑病主要危害叶片，病斑为灰褐色，表面分布深褐色霉点，会造成叶片脱落或变形，严重时会使植株死亡[5]。流胶病也会影响白蜡树的生长，其发生与气候、栽培管理水平、土壤土质等有相关性，真菌侵染或者病虫侵入都会导致流胶病，具体症状为白蜡枝干流出黄色胶状物质，最终导致树体衰弱、枯竭[6]。白蜡枯梢病由白蜡鞘孢菌所致，病部出现溃疡或坏死，且木质部褪绿明显，当病斑扩展环绕枝条，就会产生枯梢[7]。按昆虫类别划分，为害白蜡树的常见害虫有蝉蛾目瘦蛾科害虫，鳞翅目、膜翅目、半翅目、鞘翅目等害虫。白蜡树从春天长叶到秋冬落叶，均受害虫侵扰[8]。白蜡窄吉丁初孵幼虫会从白蜡树韧皮部啃食至木质部，导致树皮开裂、脱落[9]。白蜡梢距甲成虫啃食树苗叶柄，使得叶片萎缩，幼苗不能正常生长[10]。总之，多种病虫害导致白蜡树生长发育缓慢，外观受损严重甚至死亡，不利于环境美化和经济效益提高。因此，鉴定白蜡树病虫害的对白蜡树的生长及相关产业发展具有重要意义。

链格孢属（Alternariaspp.）真菌寄主广泛，可为害粮食作物、蔬菜、花卉、数木等多种经济作物，导致严重的经济损失，链格孢菌（Alternaria alternata）广泛分布在粮食、饲料、土壤和腐烂有机物质中，部分致病的链格孢菌对其寄主植物具有致病毒素，从而侵染寄主植物[11]。如柑橘链格孢褐斑病主要危害橘、柚、橙等，引起落叶落果和枯梢，带病斑果实难以销售[12]。链格孢侵染枸杞后，会产生典型黑霉病症状，病斑周围呈水渍状，中部产生白色菌丝，果实渐渐软化、变黑，失去经济价值[13]。罗光明等[14]通过转录组技术研究了栀子接种链格孢菌后在基因转录上的差异，分析了关键通路和关键基因，有助于探明链格孢菌与植物的互作机制。文中探明对白蜡树叶片的致病菌进行了形态学鉴定和分子生物学鉴定，以期为白蜡树病害防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌种 供菌种鉴定的白蜡树病叶实体于2022 年7 月28 日采摘于怀化市芷江县杨家坪镇。

1.1.2 培养基 PDA 培养基：200 g 马铃薯切成小块，沸水煮30～40 min，取纱布过滤，冷却至室温，加入葡萄糖20 g，加ddH2O 定容至1 L，分装至200 mL 锥形瓶（配置固体培养基每瓶加入琼脂3 g），121℃，灭菌20 min，冷却后放置4℃备用。

1.1.3 主要试剂 T5 Direct PCR Kit 购买自Tsingke Biotechnology 生物有限公司。引物采用真菌通用引物ITS1、ITS4，由Tsingke Biotechnology 生物有限公司合成，引物序列为ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3';ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种分离 内生菌的分离参考袁珊珊等[15]方法进行了细微的调整。将采集的病叶在超净台内用1% NaClO 浸泡1 min，随后转入75% 乙醇中浸泡1 min，用手术刀片轻轻切割病斑，用接种针小心取出中间病叶，最终获得2 mm×2 mm 含有病菌的病叶，小心接种在PDA 平板培养皿中，每个培养皿接种一个菌块，重复5 次，放置于28℃恒温培养箱中培养，每日观察菌株生长情况2 次。该菌株编号Z3727-10。

1.2.2 菌丝DNA 提取及检测 当菌丝生长至直径为3 cm 时，取边缘菌丝，在超净台切割成1 mm×1 mm菌丝块接种至PDA 液体培养基中，28℃，200 r/min培养，每天观察菌丝生长情况，待菌丝长至合适大小，用滤膜过滤培养基，保留菌丝球，利用CTAB 法进行基因组DNA 提取，将提取的DNA 置于-20℃冰箱保存备用，取2 µL 提取的DNA 经1%琼脂糖凝胶电泳检测，使用Syngene G:BOX 凝胶成像系统进行拍照。

1.2.3 PCR 扩增及其序列鉴定 以提取的基因组DNA 为模板，应用真菌通用引物ITS1和ITS4进行PCR 扩增，PCR 扩增体系为2×T5 Direct PCR Mix 12.5 µL，上游引物1 µL，下游引物1 µL，DNA 样品0.5µL，加ddH2O 定容至25 µL；PCR 扩增程序为98℃预变性3 min；98℃变性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸30 s，共计30 个循环；最后72℃延伸5 min， 4℃保持。PCR 结束后取10 µL PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，并将产物送至北京擎科生物科技股份有限公司进行测序。测序结果登录NCBI 进行Blast 比对鉴定。

2 结果与分析

2.1 菌种形态特征

采集的叶片病斑如图1 所示，病斑呈黑色，圆形，表面光滑，病斑中心扁平。菌种分离生长形态如图2 所示，分离的菌丝在生长速度上并无明显差异，菌丝长势和菌丝浓密程度差异不大，菌丝光滑，有光泽，正面呈白色向四周蔓延生长，背面有前期黄色物质析出，后期呈现黑色，菌丝分布茂密，菌落呈半透明状，无水滴析出。

图1 白蜡树病叶

图2 白蜡树病叶分离的病菌菌丝形态

2.2 菌丝DNA 提取及PCR 扩增

利用CTAB 法提取Z3727-10 菌丝总DNA 进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，DNA 条带清晰明亮，无拖尾现象，检测结果表明DNA 提取效果良好，基因组DNA 完整，可以用作后续PCR 试验。以DNA 为模板，利用真菌鉴定通用引物进行PCR扩增并对结果进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果（图3）显示目的产物条带大小与预期结果相同。

图3 ITS-PCR 凝胶电泳检测

2.3 序列比对

对PCR 产物进行测序，结果显示，PCR 产物长度为585 bp，且为单峰，表明菌种分离纯化成功，无其他杂菌污染，获得单一菌种。将目的基因序列在NCBI 中进行比对，结果（图4）表明，与待鉴定菌种相似性最高的菌株为Alternaria alternata，query cover 为100%，per.ident 为100%，最终确定病原菌为Alternaria alternata（黑斑病菌）。并对菌种鉴定结果进行系统进化分析，结果如图5 所示，从图5中可以看出，Z3727-10 属于链格孢属（Alternala）。

图4 序列比对结果

图5 菌种系统进化发育树

3 讨 论

鉴定白蜡树病害的病源菌有助于采取有效措施防治白蜡树病害，对白蜡树的生长发育及相关产业的发展具有重要意义。将病原菌进行分离后培养，观察菌丝形态，测定生长速率难以准确判定病原菌种类，目前多采用ITS等分子鉴定手段对菌种进行鉴定，国际核酸库信息资源不断丰富，将ITS序列与GenBank 数据库进行Blast 比对，序列相似性≥99%，即可以鉴定为相同种[16]，通过对白蜡树病害菌种的形态观察及基因库比对，最终确定病原菌为Alternaria alternata（黑斑病菌）。

黑斑病菌对多种植物如枣树、苹果梨、金刺梨等均可造成危害。研究报道，黑斑病入侵枣树后，一般在果实白熟期开始显现症状，且病斑多在果实顶端或果实脐部，对果实口感造成影响，严重时造成果实腐烂，减产40%[17]。黑斑病菌经果皮入侵，但在果实采摘时无性状，贮藏时发病率可高达37%[18]。研究表明，80%多菌灵可湿性粉剂、75%百菌清可湿性粉剂、70% 甲基硫菌灵可湿性粉剂可在室内有效抑制黑斑病菌[19]。因此，鉴定白蜡树病菌，并及时采取有效防治措施，对保护白蜡树与减少经济损失具有重要意义。