刺激响应型光声纳米探针的构建及其生物医学应用研究

袁 茜，李一荣

（武汉大学 中南医院检验科，湖北 武汉 430071）

1949 年，莱纳斯·鲍林于《科学》杂志上发表论文《镰状细胞性贫血，一种分子疾病》［1］，首次从分子水平上解释了镰状细胞性贫血的成因，揭示了疾病的发生与发展在分子层面的重要意义，并开启了分子生物学在生命科学研究中的序幕。随着研究进程的深入，美国国立卫生研究院（NIH）肿瘤研究所卡普和布罗德两位学者于1994 年在《癌研究》杂志发表题为《分子医学的新方向》的论述［2］，正式提出了分子医学的概念。过去的七十多年中，分子医学对生命医学的发展起到了巨大推动作用。分子医学旨在通过从分子层面对重大疾病进行识别、量化以及动态定位，以了解疾病发病机制，并制定合理的诊断策略以及干预手段。在恶性疾病的治疗中，实现病灶的及时识别与精准评估对于改善患者的发病率以及死亡率至关重要［3］。因此以解决重大疾病的早期诊断需求为导向，为重要生物分子的传感及成像提供有效的功能分子探针，是分子医学研究领域的关键所在。

目前，已经有一系列非侵入型分子传感及成像技术被应用于重大疾病的早期诊断［4］，包括光学成像、磁成像、超声成像等。在众多的成像手段中，光学成像技术特异性好、分析灵敏度佳、时空分辨率高，能够在分子、细胞、组织乃至器官水平，对分子事件进行实时、动态的可视化成像，在分子医学研究领域受到了广泛的关注［5］。近年来，荧光、表面增强拉曼散射、光声等光学技术的发展极大促进了光学成像技术的应用。其中，光声成像技术是一种新兴的非侵入性光学成像技术，具有重要的临床转化潜力［6］。光声成像依赖于光声效应［7-8］，即当脉冲激光照射至生物组织时，光声探针吸收光能引起组织结构瞬间热弹性膨胀，从而产生超声信号。这种信号经高灵敏的超声探测器接收，并通过算法重构形成光声图像（图1）。因此光声成像探针兼具光学探针以及声学探针的优势［9］，即高的成像对比度以及深的组织穿透性。通过调控激光波长，光声成像技术能够利用多种生色团在体内的映射实现在体的有效监测［10］。例如，通过对一系列内源性成分进行监测，如血红蛋白、肌红蛋白、黑色素等，光声成像手段能够有效获得在体血氧等身体指标信息。然而内源性光声探针数量有限，极大程度上限制了光声成像技术的发展［11］。基于此，具有良好生物相容性以及优秀光声转化性能的小分子有机染料，如吲哚菁绿（ICG）、亚甲基蓝、吡咯硼（BODIPY）系列染料，受到了研究者们广泛的关注，并在重大疾病的早期诊断中展现出良好的应用潜力［12］。然而，小分子有机染料在活体应用中存在肾脏清除率高、生物利用率低、易光漂白等局限性［13-14］，限制了其进一步的应用。

图1 光声成像原理图［7］Fig.1 Schematic of the principle of photoacoustic imaging［7］

得益于纳米生物技术的快速发展，基于纳米功能材料所设计的光学纳米探针为解决这些问题带来了契机。与传统基于染料的光学探针相比，纳米探针本身固有的光学性质以及可设计的物化性质为改善光学探针的灵敏度、特异性、靶向性提供了可能。然而传统纳米光声探针的信号输出主要为“信号常亮”模式。这种绝对强度依赖型的信号采集方式可能受到非特异性作用影响［15-17］，例如病理组织与正常组织的组织渗透性与滞留性的差异；纳米探针在活体中潜在的脱靶效应等，从而降低探针的特异性以及信背比。考虑正常组织与病理组织微环境的差异性，通过合理设计开发刺激响应型光声纳米探针能够有效改善探针的特异性，提升探针的信背比，有助于更好地理解及诊断癌症、神经退行性疾病、心血管疾病、炎性疾病等重要疾病。本文阐述了激活型光声纳米探针在分子诊断中的研究进展，讨论了激活型纳米光声探针在生物医学领域的挑战与前景。

1 刺激响应型光声成像探针设计策略

与传统“信号常亮”型光声探针相比，激活型光声成像探针可通过响应刺激实现光声信号特异性转变［15］，设计策略包括“单因素激活”与“双因素激活”两种构建方式。

1.1 单因素刺激响应型设计策略

在“单因素激活”的探针策略中，通常一种光声信号代表一类待测事件，相关信号输出有“打开型”与“关闭型”两种方式。在“打开型”探针中，探针一般处于猝灭态或仅具有微弱信号，通过响应刺激从而实现信号“打开”。在“关闭型”探针中，成像模式则相反。相比之下，“打开型”光声探针能够有效降低假阳性信号的干扰。Miao 课题组开发了Caspase-3 活化的组装型光声成像探针dCyFF（图2A）［18］，用于监测放射疗法的疗效。dCyFF 探针以半花菁染料为核心，并连接有Caspase-3 可裂解的肽底物以及促进自组装的肽段。在Caspase-3存在的情况下，该探针发生水解并实现自组装成更大的纳米颗粒，从而激活光声信号，实现放疗反应的及时评估。然而，这一类“单因素激活，单信号输出”光声探针的传感能力高度依赖于单信号光声探针的采集性能，探针堆积不均、成像灵敏度低、光漂白等潜在问题均会影响此类光声探针的成像效果。相比之下，“单因素激活，双信号输出”型光声探针可通过信号内置校准功能，有效改善单信号输出方式存在的上述问题，进一步提升探针准确度。Song 课题组利用纳米金等离子体共振效应，通过精准调控纳米金表面聚合物比例，同时引入半导体光声参比探针SD-825，构建了不对称构型的有机-无机纳米组装体（图2B）［19］。随着环境pH 值变化，该不对称组装探针中金纳米模块的光声信号发生相应变化，结合参比探针SD-825 信号，从而实现pH 值激活式精准的比例型光声定量监测，显著降低了外界因素对成像结果的影响。

图2 Caspase-3介导dCyFF纳米探针激活用于增强型成像［18］（A）；pH响应型不对称构型纳米组装体的比率型光声探针［19］（B）；pH与还原态双刺激响应型诊疗探针的作用机制［20］（C）；GSH/H2O2双响应型BSA-Cy-Mito纳米探针用于炎性的光声成像［21］（D）Fig.2 Caspase-3-activatable dCyFF nanoprobe for enhanced imaging［18］（A）；pH-responsive Janus nanocomposite as ratiometric PA probe［19］（B）；responsive mechanism of pH/reduction dual stimuli-responsive theranostic probes［20］（C）；GSH/H2O2-responsive BSA-Cy-Mito nanoprobe for PA inflammation imaging［21］（D）

1.2 双因素刺激响应型设计策略

为进一步改善光声探针在复杂环境中的特异性，研究者们开发了一系列双因素刺激响应型光声探针。双因素刺激响应型探针主要包括“双因素激活，单信号输出型”与“双因素激活，双信号输出型”两种探针类型。由于一种异常病理分子可能同时存在于不同病理事件中，因此开发“双因素激活，单信号输出型”光声探针可有效提升疾病诊断的特异性。Shi 课题组开发了能够同时响应肿瘤微环境低pH 以及谷胱甘肽的光声探针Cy-1（图2C）［20］，通过发生分子间的CBT-Cys 缩合反应实现探针的组装聚集，从而显著提升探针光声成像的性能。此外，具有两个检测窗口的“双因素激活，双信号输出型”探针能够实现多重目标的逻辑化检测，进一步拓展了光声成像的通用性。Tang 课题组通过引入牛血清白蛋白用于组装谷胱甘肽响应型荧光探针Cy3-NO2以及过氧化氢响应的荧光探针Mito-NIRHP，开发了组装型探针BSA-Cy-Mito（图2D）［21］，从而实现了谷胱甘肽以及过氧化氢的同时响应与双光声信号输出，为构建多生物标志物检测光声探针的设计提供了参考。

2 刺激响应型光声成像探针应用

近年来，刺激响应型光声成像探针已被广泛应用于重要疾病的成像与诊疗中，主要应用可分为内源性刺激响应成像与外源性刺激响应成像两种类型。

2.1 内源性刺激响应成像

每种疾病都具有自身独特的病理特征，例如异常的pH值、自由基含量、酶水平，用以支持疾病的发生与发展。基于此，研究者们以这些异常的生理参数作为内源性刺激源，开发了一系列分子探针以实现激活型光声成像，为疾病的早期诊断与干预提供更为有效的监测手段。

2.1.1 pH 响应型成像pH 值是衡量细胞稳态的重要生理参数。异常的pH 值与癌症、炎症性疾病等息息相关［22-24］。例如为了支持肿瘤的快速生长与增殖，与正常细胞相比，肿瘤细胞能量代谢方式发生改变，导致代谢物（如乳酸等）的胞外积累，胞外间质pH值降低。基于这种独特的病理环境，研究者们设计了一系列pH响应型探针用于激活型光声成像。溶酶体是一种由单层膜包被的，含有多种酸性水解酶的囊状异质性细胞器。与正常细胞相比，肿瘤细胞的溶酶体具有数量偏多、体积偏大、组织蛋白酶活性偏高等特点。Song 课题组［25-26］基于肿瘤酸性微环境的特点（pH 值在6.5~6.9 区间）及肿瘤细胞溶酶体过度发育的特征（pH 值在4.6 左右），以牛血清白蛋白（BSA）为模板开发了粒径在6 nm 左右的Cu2-xSe-BSA 纳米探针（图3）。该探针随着环境pH 值降低会逐步发生聚集。在到达肿瘤区域后，Cu2-xSe-BSA 纳米探针在肿瘤酸性微环境中会进行自组装，并进一步地在肿瘤细胞溶酶体中组装形成超团簇，实现pH值响应的增强型光声成像及协同治疗疗效。

图3 Cu2-xSe-BSA纳米探针用于增强型多模态成像及协同治疗［25］Fig.3 Cu2-xSe-BSA nanoprobe for enhanced multimodal imaging guided synergistic therapy［25］

2.1.2 酶响应型成像酶作为维持机体功能的重要组成成分，在多种重要生命活动中发挥着重要的作用，例如增殖、迁移、分化、血管生成、衰老、凋亡等［11，27-28］。类似于其他重要生物标志物，酶水平的异常表达与众多疾病的进程息息相关。弗林蛋白酶是一种反式高尔基蛋白转化酶，在多种恶性肿瘤中均呈上调状态，是肿瘤诊疗的重要生物标志物。Wang 课题组［29］基于缩合反应，开发了弗林蛋白酶介导的聚合响应型金纳米颗粒光声诊疗探针。当内化入癌细胞后，探针在胞内弗林蛋白酶以及还原型谷胱甘肽的识别及响应作用下，通过剪切掉保护基团并裸露出缩合反应基团，从而诱导金纳米颗粒胞内聚集，实现增强型光声成像以及治疗效果。动脉粥样硬化起病具有隐蔽性与突发性的特点。患者发病前没有明显症状及征兆，往往难以实现及时治疗。因此，实现对于动脉粥样硬化斑块的早期诊断与及时预防极其重要。一系列研究表明，组织蛋白酶B 参与了血管病变的发生、进展、破裂的全过程。异常升高的组织蛋白酶B 会扰乱易损斑块完整性，引发斑块破裂，是预测斑块易损性的潜在性指标物。基于此，Zhang 课题组［30］将亲脂烷基链和亲水组织蛋白酶B 底物偶联至半花菁支架上，开发了双响应型组织蛋白酶B 探针L-CRP 用于监测亲脂环境中组织蛋白酶B 的活性。该探针使用脂质与组织蛋白酶B 作为“激活因素”，只有当两种“激活因素”同时存在时，才能激活光声信号，从而实现动脉粥样硬化斑块组织蛋白酶B 的特异性识别（图4）。

图4 双锁型L-CRP探针用于监测亲脂环境中的组织蛋白酶B［30］Fig.4 Double-locked L-CRP nanoprobe for the imaging of intraplaque CTB levels［30］

2.1.3 自由基响应型成像自由基作为生命体关键的信号分子之一，在维持细胞代谢稳态、调控细胞生理功能等方面发挥了重要作用［31］。正常情况下，生命体的自由基水平受到严格调控以满足机体正常需求。一旦机体内自由基代谢失衡，机体将发生氧化损伤，进而诱发一系列级联病理反应。当前已有大量证据证实癌症、心血管疾病、神经退行性疾病等重大疾病的发生发展与自由基代谢失衡相关［32-34］。然而自由基在体含量低、寿命短，如何开发光声成像策略用于监测在体自由基水平变化是当前亟待解决的问题。急性肝衰竭起病及进展迅速，实现急性肝衰竭的早期诊断对于患者有效治疗极具意义。活性氧作为急性肝衰竭重要的早期病理标志物，其过度积累会触发肝细胞损伤乃至坏死，导致氨酸转氨酶（ALT）释放至血液中，并刺激肝巨噬细胞产生一系列促炎因子，加重肝损伤进程。为实现急性肝衰竭的早期诊断，Li课题组［35］克服自由基成分寿命短、原位成像困难的问题，开发了活性氧响应的增强型光声纳米探针（RSPN）用于急性肝衰竭的早期诊疗。RSPN 探针以活性氧敏感的两亲性二硒化物作为偶联单元，整合近红外光声造影剂酞菁锌与能够催化分解活性氧并生成氧气气泡的铈纳米催化剂两大功能单元，形成两亲性功能结构。在血液循环过程中，被包覆在疏水核中的酞菁锌与铈纳米催化剂处于“关闭状态”。当暴露在富含活性氧的受损肝脏微环境中时，RSPN 探针中的二硒键经活性氧切割，导致探针构型转变，从而释放酞菁锌与铈纳米催化剂。由于分子间的疏水作用与芳香族π-π堆叠作用，释放的酞菁锌重新聚集为大颗粒并通过非辐射热失活途径生成光声信号。此外释放的铈纳米催化剂通过催化自由基生成氧气气泡，并利用惯性空化效应进一步放大光声成像信号，从而实现急性肝衰竭的早期高效诊断。此外，针对自由基代谢失衡的细菌感染性疾病，Song 课题组［36］制备了银壳包覆钯尖端金纳米探针（Au-Pd@Ag）用于原位监测细菌感染诱发炎症模型中的标志物H2O2。在炎症部位，H2O2通过刻蚀银壳结构释放Ag+，从而导致纳米银层光声信号（近红外一区，700 nm）降低，而裸露出的钯尖端金纳米棒相应的光声信号（近红外二区，1 260 nm）增强。通过监测比例型光声信号的变化，该光声探针能够更好地反映炎症过程中H2O2的含量。

2.1.4 miRNAs 响应型成像MicroRNAs（miRNAs）是一类内源性非编码单链短分子RNA（18~22 nt）。在一系列生理过程中，miRNAs均起着至关重要的调节作用。尽管细胞内miRNAs丰度较低，其异常表达水平仍与众多疾病紧密相关［37-38］，实现胞内miRNAs的动态成像可为监测生命病理行为提供重要参考信息。急性肾损伤是一种肾脏功能迅速衰竭和丧失的疾病，是临床住院患者常见并发症之一，具有高的发病率与死亡率，已成为全球性重大公共卫生问题。对急性肾损伤患者的及时诊断可为病患提供关键的治疗时间窗口，避免病情发展至慢性肾病或终末端肾病。然而当前临床诊断方法主要依赖于血清学生化检测，这些方法并不能有效地实现急性肾损伤的早期诊断。鉴于此，He 课题组［39］开发了miR-21 响应的纳米天线用于实现急性肾损伤的早期诊断与治疗。该纳米天线由矩形DNA 纳米折纸连接两个金纳米棒（rDONs@AuNR 二聚体）组成，其表面等离子体共振峰位于近红外窗口内，使得探针能够实现深层组织的光声成像（图5）。在血液循环过程中，rDONs@AuNR 二聚体光声信号一直处于“打开状态”。基于miR-21在急性肾损伤小鼠肾部高表达的现象，在损伤肾组织中通过miR-21 引发纳米天线粘性末端介导的链置换反应，使金纳米棒与DNA 纳米折纸解离，二聚体结构遭到破坏，进而导致光声信号下调。研究结果表明，在注射10 min 后，该探针即可实现缺血再灌注诱导急性肾损伤小鼠的及时诊疗，这种策略的开发为急性肾损伤的早期诊断提供了新途径。

图5 rDONs@AuNR纳米天线用于急性肾损伤的早期诊断与治疗［39］Fig.5 rDONs@AuNR nanoantenna for early diagnosis and smart treatment of acute kidney injury［39］

2.1.5 其他因子响应型成像内源性气体是生命机体信号转导的必要信号分子。其中硫化氢分子作为强还原性气体分子，在维持生命体氧化还原稳态上发挥了重要作用。在异常分子事件中动态监测硫化氢分子含量变化有助于更好地理解病理进程，为疾病的及时干预提供重要手段。Ye课题组［40］构建了能够快速、可逆响应硫化氢以及羟基自由基的比率型光声探针（1-PAIN）。可逆型1-PAIN 探针在PA690/PA825 处展现较低的比值，在羟基自由基的氧化作用下PA690/PA825 比值强度增加了近5 倍，而在硫化氢的还原作用下PA690/PA825 比值强度降低至较低水平，因此该探针能够动态监测生理环境下硫化氢以及羟基自由基的含量变化。在脂多糖诱导的小鼠肝炎模型中，1-PAIN被证明能够动态成像炎症部位的羟基自由基水平。此外在使用N-乙酰半胱氨酸给予小鼠进行抗炎治疗过程中，1-PAIN能够可视化硫化氢分子生成的过程。生物硫醇，例如同型半胱氨酸、谷胱甘肽、半胱氨酸等，在维持生命机体活动中发挥着重要作用。谷胱甘肽作为细胞内含量众多的小分子硫醇类抗氧化剂，在肿瘤组织中的含量远高于正常细胞。基于此，Zhao 课题组［41］开发了肿瘤微环境诱导吸收光谱红移型铁、铜共掺杂聚苯胺纳米探针（Fe-Cu@PANI）。在肿瘤微环境中，Fe-Cu@PANI二价铜离子与谷胱甘肽发生氧化还原反应，诱导探针表面刻蚀，随着谷胱甘肽浓度增高，探针粒径逐渐减小，并产生质子化聚苯胺，诱导Fe-Cu@PANI 吸收光谱从可见光区域红移至近红外光区域，从而激活探针光声成像，实现肿瘤微环境激活的原位动态光声成像。

2.2 外源性刺激响应成像

外源性刺激主要包括光、热、超声等刺激形式。以外源能量作为刺激源的成像模式具有刺激源强度与靶点精准可控的优势，因此受到研究者们的广泛关注。

2.2.1 光响应型成像光学刺激源具有清洁、可控的优势，通过调控照射光的波长、功率以及曝光时间，能够实现光响应型探针的实时、精准成像［42］。与可见光相比，近红外光具有更深的组织穿透性，在生物医学应用领域具有天然的优势。Zhang课题组［43］构建了负载二酮吡咯聚合物以及吲哚菁绿的上转换纳米颗粒用于实现近红外光响应生物正交的安全型光声成像（图6）。在激发光源为980 nm 的连续光激发下，上转换颗粒能够发射出较强的800 nm 近红外光以激活吲哚菁绿从而实现有效的光学动力学治疗。通过精准调节激发光的脉冲宽度，在980 nm的短脉冲激光下，上转换颗粒在800 nm 处的近红外发射光几乎消失，产生的可见发射光被二酮吡咯聚合物捕获，因此上转换颗粒可在不产生明显光毒性的情况下展现出强烈的光声信号，实现在体肿瘤的长期性实时成像。

图6 红外光切换型上转换纳米复合物用于光声成像与正交激活型治疗［43］Fig.6 Orthogonal regulation of UCNPs-DI for photoacoustic imaging-guided on-demand treatment［43］

2.2.2 温度响应型成像温度响应型纳米探针的发展进一步拓宽了分子影像的应用，然而现有的温敏型纳米探针所需转变温度普遍偏高，并且可逆性较低，极大程度限制了温敏型探针在体实现长期有效的检测。基于此，Xing 课题组［44］开发了一种热响应型聚乙二醇包覆的钨掺杂二氧化钒纳米探针（图7）。该探针在超过临界温度（41.1 ℃）的环境下发生绝缘体-金属相变，导致其近红外二区的光学吸收性能急剧增强，探针在1 064 nm 处的光声信号相应增强。而当温度回归正常时，该纳米探针迅速转变为低吸收性能的绝缘体相。在10 个温度循环后，探针仍能保持较强的转换能力。该探针的构建为开发高性能温敏型光声成像探针提供了新的指导。

图7 温度响应型W-VO2@PEG复合物用于动态增强型光声成像［44］Fig.7 Temperature-responsive W-VO2@PEG NPs for dynamicenhanced photoacoustic imaging ［44］

2.2.3 超声响应型成像超声是一种周期性的高频机械波，其频率超过人类听力阈值，具有可操控性、无创性、安全性、高度穿透性等特点，目前已被广泛应用于临床诊断中［45］。然而超声成像分辨率较低，限制了其在临床诊疗中进一步的应用。基于此，Liu课题组［46］结合超声高频可控性以及光声近红外成像的特点，开发了一种基于金纳米颗粒的微泡型超声响应光声成像探针（Au@lip MBs），用于实现“零背景”光声成像（图8）。在近红外光激发下，Au@lip MBs仅表现出较低强度的光声信号。当探针暴露在超声脉冲下时，Au@lip MBs会破裂，形成Au@lip纳米级的聚集体。由于聚集体表面等离子体共振吸收峰的红移，探针展现出超声响应的增强光声信号。因此通过扣除超声脉冲前探针展现的信号，即可实现超声响应的“零背景”高灵敏光声成像，为复杂环境中待测物的精准检测提供了新的思路。

图8 超声响应型Au@lip微泡用于无背景光声成像［46］Fig.8 Ultrasound-responsive Au@lip MBs for background-free photoacoustic imaging［46］

3 结论与展望

分子影像技术已成为解析复杂生物现象及实现精准医疗的重要工具。在众多分子影像技术中，光声成像技术具有良好生物安全性，能够实现高分辨的实时动态成像。得益于材料学与生物医学交叉学科的发展，基于纳米生物技术的可激活型光声造影平台能够特异性响应刺激，实现复杂病理模型的精准诊断，在多种疾病体系中均展现出良好的应用前景。相比于传统的“信号常亮”型光声探针，激活型光声成像探针能够通过响应外源性或内源性的刺激，实现光声信号的特异性变化。本文从刺激响应模式与信号输出模式的角度出发，介绍了单因素刺激响应型策略以及双因素刺激响应型策略的设计原理以及具体应用。根据所总结的激活构建策略，本文以内源性及外源性刺激响应方式作为分类，通过综述当前光声成像探针在多种重要生物靶点中的检测方法，详细讨论了内源以及外源激活型光声成像探针在生物医学中的应用，回顾和总结了响应型光声成像探针设计策略的研究进展。尽管激活型光声成像技术已取得了一定进展，然而仍面临一系列挑战：（1）当前响应型光声成像探针的设计策略仍集中于“单信号输出”类型，未来亟需开发新型“双信号输出”光声成像策略，用于精确定量靶标分子。（2）近红外二区成像探针具有活体穿透度深，组织自发荧光低及信噪比高等特点，在光声成像领域展现了极大的应用前景。然而当前近红外二区型光声成像探针设计较为困难，量子产率较低，设计开发新型高效的近红外二区影像探针对于光声成像具有重要意义。（3）每种成像技术都具有自身独特的性质，单一的成像方式无法全面反映生命体的整体特征。通过将光声成像与其他成像技术融合，设计并构建多模态成像技术是实现精准成像的有效途径［47］。随着分子医学的进一步发展，使用光声探针用于特异性疾病的成像已不足以满足研究需求，开发特定疾病靶点活化型的光声探针对于相应疾病的诊断与治疗具有重要的应用前景。这些激活型光声成像探针能够特异性区分病灶部位以及健康组织，有效地降低外源性探针的系统毒性，并实现疾病的实时监测。然而如何优化外源性探针的稳定性、生物相容性以及生物降解性，并且利用激活型光声探针进一步引导手术干预，给药治疗，仍是当前临床转化中亟需解决的问题。我们相信，随着研究的进一步深入，激活型光声成像技术将得到更加全面的探索，并进一步推动光声成像的临床应用，助力于精准分子医学研究。