环境敏感型碳点响应机制及其在生物传感领域的应用

霍泽鹏，徐蔚青，徐抒平，2，3*

（1．吉林大学 化学学院，超分子结构与材料国家重点实验室，吉林 长春 130012；2．吉林大学 化学学院，超分子化学生物学研究中心，吉林 长春 130012；3．吉林大学 化学学院 理论化学研究所，吉林 长春 130012）

碳点是一种新颖的荧光纳米材料，凭借良好的生物相容性、光稳定性和水分散性常被用于检测、生物成像等领域［1］。碳点主要分为石墨烯量子点、碳量子点、碳纳米点和碳化聚合物点四种类型，其发光机制则可分为碳核态、表面态、分子态和交联增强发射等［2］。碳核态荧光机制强调碳点的荧光是由于其所具有的共轭结构所产生，其荧光强度受到共轭大小的制约［3］。表面态发光机制主要强调连接在碳核或者碳点表面的短链结构以及含有氮、氧等元素的官能团与碳核的协同作用［4］。分子态发光理论不同于表面态，是指在自下而上合成碳点反应的初期阶段，前驱体通过分子内或者分子间脱水，形成低碳化程度的产物，即分子残基［5］，这些分子残基或有机分子发光团会发射荧光。交联增强发射指在碳点形成过程中，这些潜在的荧光中心通过聚合物化学交联、锚定作用以及超分子网络放大其荧光特性，而其所形成的结构也通过限制这些官能团的振动和转动抑制其非辐射跃迁过程，提高荧光发射的效率，进而增强荧光［6］。

环境敏感碳点可对所处介质的微环境（如溶剂极性、溶剂粘度、pH 等）产生响应，并导致自身发射、吸收光谱的改变，从而可以实现对周围环境的传感和测量。目前具有此类性质的发光碳材料的发光机制仍不清晰。本文对环境敏感型碳点的发光机制及相关应用进行了综述，具体可分为pH敏感型碳点、极性敏感型碳点、粘度敏感型碳点和温度敏感型碳点四个类型。简述了环境敏感型碳点的合成原料、传感性能，并综述了其在生物分析检测领域中的应用。

1 pH敏感型碳点

1.1 pH敏感碳点的响应机制

pH 值是非常重要的生理指标，在多种生物过程中起着重要作用。pH 可诱导碳点的发光发生改变，主要有以下解释：①能级改变；②表面的含氧、氮官能团发生质子化和脱质子化；③分子内电子转移的调制；④聚集形态转变。在机制的探索过程中，人们通过多种表征手段探究了不同酸碱条件下碳点表面官能团的变化，并通过诸如瞬态吸收等光谱手段详细阐述了其发光机制。

针对pH 敏感碳点设计，许多pH 敏感型碳点在选择前驱体时会使用一些含有氨基、羧基的有机小分子，这是由于表面的含氮、氧官能团会发生质子化和脱质子化从而影响能级结构，进而影响其荧光行为。因此，在设计pH敏感型碳点时，通常会考虑选择含有上述官能团的碳点。

碳点官能团的差异可使碳点对pH 有响应。Wang 等［7］采用水热合成方法通过1，2，4-三氨基苯和NaOH 制备了一种pH 敏感碳点，以630 nm 和590 nm 处的荧光发射峰位强度比和pH 数值进行拟合，发现碳点随着溶液pH值的增加，荧光强度逐渐上升，但在接近中性之后荧光强度略有下降并伴随峰位蓝移，这暗示部分结构发生了质子化和脱质子化，改变了激发能级。他们通过Zeta电位数据得出在pH变化的过程中—OH 和—COOH 基团变为—O—和—COO—，从而导致荧光行为变化（图1A~E）。Karami等［8］通过傅里叶变换衰减全反射红外光谱法详细探究了不同pH下的碳点，发现偶氮基团（1 545 cm-1）在中性pH 时强度最高，在酸性pH 时强度最低。他们通过滴定方法对合成碳点的pKa 进行测定，证明了不同酸碱环境下的发射峰位差异来源于表面基团的质子化和去质子化（图1F）。Sui等［9］通过飞秒瞬态吸收光谱描述了不同pH下碳点的载流子动力学，发现在碱性环境中碳点的衰减速率较快，而在酸性环境中却较慢。通过全局拟合的方式对碳点激发态弛豫过程进行探究，发现在不同酸碱性环境中碳点经历了不同的中间态，且不同酸碱环境下每种组分所占的比例具有很大差异。通过结合碳点的结构对实验结果进行分析，作者认为碳骨架周围的碳原子和含氧官能团导致了pH的变化，羧基的质子化和脱质子化影响了整个发光过程（图1G）。

图1 CDs的准备步骤（A），吸收光谱（B）及发射强度（C）随pH值的变化［7］；不同pH值下CDs溶液在可见光和紫外线灯照射下的照片［7］（D）；在可见光和紫外线灯照射下，不同pH值下CDs的pH试纸的照片［7］（E）；CDs在pH值为3.0、7.0和9.0时的ATR-FTIR光谱［8］（F）；CDs在不同pH值溶液中被400 nm激光脉冲激发后在600 nm处的归一化瞬态衰减动力学［9］（G）；Cu2+钝化CDs在不同pH值下的紫外-可见吸收谱［11］（H）；在室内照明下，制备的（上）和Cu2+钝化的（下）CDs在不同pH值下的照片［11］（I）；用405 nm激光激发Cu2+钝化的CDs的荧光pH依赖性行为［11］（J）；CDs在pH 4.0和pH 11.0的水溶液中的TEM图像［13］（K）Fig.1 Schematic illustration of the preparation procedure for the CDs［7］（A） . The absorbance intensity ratio changes（B） and emission intensity ratio changes（C） varied with pH values［7］.Photographs of the CDs solutions at different pH values under visible light and UV lamp irradiation［7］（D） . Photographs of pH test paper loaded with CDs at different pH values under visible light and UV lamp irradiation［7］（E）. ATR–FTIR spectra of CDs at pH 3.0，7.0，9.0［8］（F） . Normalized transient decay dynamics of CDs at 600 nm at different pH solutions after being excited by 400 nm laser pulse［9］（G）. UV–Vis absorption of Cu2+ passivated CDs under different pH values［11］（H） . Photographs of as-prepared（up） and Cu2+ passivated（down） CDs aqueous colloid with the same low concentration at different pH under indoor lighting［11］（I）.The pH dependent behavior for the PL of CDs with Cu2+ passivation excited by 405 nm laser［11］（J）.TEM images of CDs in aqueous solution at pH 4.0 and pH 11.0［13］（K）

pH诱导碳点产生的质子化和脱质子化除了改变碳点的能级结构外，还会引起碳点官能团与发射位点之间的电子转移，从而引起荧光发射的变化。Lü 等［10］发展了一种pH 敏感碳点，随着pH 值的减小，荧光强度逐渐减弱。他们将碳点的这种传感机制归因于碳点表面的氨基质子化增强了—NH3+和碳点之间的分子内电子转移能力，从而导致荧光猝灭。

除上述官能团的差异会造成碳点对pH 响应之外，H+/OH-所引起的能级变化也被认为是碳点对pH响应的原因之一。Kong 等［11］报道了具有不同表面修饰的pH 敏感性碳点。随着pH 值的改变该碳点荧光发射峰位可产生显著变化，发射颜色从蓝色变为绿色。这变化是由于OH—钝化碳点表面缺陷，形成了一种保护壳层，进而使得碳点被周围溶液所隔离，而辐射跃迁受到抑制，从而导致荧光强度和发射峰的改变。当溶液环境变为酸性时，H+可破坏OH-所形成的保护壳层，增加碳点尺寸，进而导致荧光猝灭和发射峰红移（图1H~J）。

碳点产生pH 敏感特性的另一个原因是pH 导致的碳点聚集和解聚集。通常在酸性环境中碳点会通过聚集形成较大颗粒，从而猝灭其荧光，这种敏感机制可通过TEM 观测不同环境下碳点的粒径得以判断。Chen 等［12］通过对苯二胺和氨水合成了一种碳点，通过观察不同pH 下的颜色变化，发现当pH 值从9.0变为1.0时，碳点的颜色从橙色变为棕色，表明碳点可能产生了聚集。他们认为，这种传感机制是由于胺基在强酸条件下的质子化导致了碳点发生聚集，进而使得荧光被猝灭。在另一项研究中，Sun等［13］同样通过对苯二胺制备了pH 敏感碳点，并发现其荧光强度随pH 值从10.62 到6.2 逐渐降低，但随pH 从6.2到4.0却急剧降低。为了验证传感机制，作者使用Zeta电位和TEM 对不同酸碱环境中的碳点进行测量。结果表明，随着pH 值的增加，电位由正变负。相应地，TEM 图像显示随着pH 值的降低出现了碳点的聚集体。综合上述结果，表明碳点表面羧基的去质子化削弱了包括氢键在内的非共价分子相互作用，诱导碳点聚集体的出现，从而导致强烈的荧光猝灭效应（图1K）。

1.2 pH敏感碳点的应用

pH 值的调节和稳态对活细胞的生存至关重要。除了生理环境下pH 值的监测，许多反应体系和反应过程也依赖于体系中pH的波动。pH敏感碳点因其优异的响应性能常被用于溶液环境内pH传感、细胞内pH 成像检测、纳米药物递送等方面的研究。Yang 等［14］通过微波辅助水热法从1，2，4-三氨基苯和尿素中制备了橙色发射的碳点，该碳点在pH 5.0~9.0 时呈现比色和荧光的双重pH 敏感性。将其与棉布复合制作新型伤口绷带可实现信号伤口愈合过程中pH的动态可视化监测（图2A、B）。

图2 O-CDs/MCC在实际应用中的示意图［14］（A）；不同pH值下缓冲溶液处理的O-CDs/MCC在自然光和紫外光（在365和254 nm激发）下的荧光图像［14］（B）；CDs的制备和溶酶体pH监测的示意图［15］（C）；用于可追踪、靶向递送抗癌药物的多功能GQD的结构示意图及其与癌症细胞的相互作用［16］（D）Fig.2 Schematic and conceptual view of the O-CDs/MCC in practical application［14］（A）. Photographs showing color appearance under natural light and fluorescence images under UV ligh（texcited at 365 and 254 nm） of the O-CDs/MCC treated by buffer solution at different pH value［14］（B）. Schematic representation of CD preparation and lysosomal pH monitoring［15］（C）.Schematic illustration of the geometry of multifunctional GQDs for the traceable，targeted delivery of anticancer drugs and their interactions with cancer cells［16］（D）

细胞内溶酶体的酸性微环境是很多靶向载体药物释放的设计依据。Zhang 等［15］基于官能团保护策略，通过加热对苯醌和乙二胺合成了一种pH敏感碳点。在该碳点合成过程中，氨基的良好亲水性及其对pH 敏感的性质均得以保留，在生理环境下表现出对pH 的灵敏响应且具备良好的光稳定性。该碳点可主动靶向溶酶体，能实时成像检测地塞米松诱导的细胞凋亡过程中溶酶体的pH变化。将其与药物分子复合后作为纳米药物载体，通过控制pH可实现对于药物的可控释放（图2C）。Qiu等［16］通过将碳点与阿霉素（Dox，一种抗癌药物）复合，发展了一种同时具有载体跟踪和药物释放能力的纳米诊疗载体。该载体当细胞内小泡酸化时，Dox 被触发释放，载体则在癌症细胞摄取后在小泡酸化处被利用，从而实现了靶细胞内pH触发的药物递送（图2D）。

2 极性敏感型碳点

2.1 极性敏感碳点的响应机制

极性是化学反应中重要的参数，溶剂的极性会影响化学反应的走向。极性并不是单一发挥作用，它包含一系列复杂的效应如氢键、偶极性等。此外，作为一种重要的物理参数，极性也与多种生理过程密切相关，如膜融合、蛋白质变性、酶构象变化等，这种异常的行为会导致如阿尔茨海默病等多种疾病的发生。已有的极性敏感探针大部分为有机小分子荧光探针，包含电子供体和电子受体结构，两者为共轭结构所连接，形成D-π-A 结构。此类结构容易发生分子内电荷转移（ICT），导致正负电荷分离，易出现较大的偶极矩。基态和激发态的偶极矩会随着溶剂极性的变化而变化，最终导致吸收和发射光谱随之改变。此外，极性敏感探针的设计原理还包含分子内电荷转移、激发态分子内质子转移（ESIPT）和扭曲分子内电荷转移（TICT）等机制。对于碳点来讲，无论是合成还是最后的分散，都依赖于溶剂。因而溶剂的特性也必将引起碳点性质的改变。碳点的极性敏感特性与碳点本身结构、其特殊的发光机制以及碳点和周围溶剂分子的作用等因素相关，但目前关于碳点具体的极性敏感和溶致变色特性的发光机制未形成统一认识。

针对极性敏感碳点的设计，通常选择含有氨基并且能够引入其他官能团的有机小分子作为反应前驱体，所形成的产物通常包含电子供体和电子受体，易形成D-π-A 结构和发生ICT 效应，从而导致正负电荷分离，并出现较大的偶极矩，而基态和激发态的偶极矩会随着溶剂极性的变化而变化，最终导致吸收和发射光谱随之改变。

不同极性的溶剂会影响碳点的激发态能级结构，产生溶剂极性依赖的发射特性。Khan等［17］利用时间分辨发射光谱揭示了碳点的激发依赖特性。经典的卡莎规则认为分子在跃迁至高能级激发态后会弛豫至最低的能级，进而返回基态，从而产生与激发无关的发射。但Khan等认为碳点的这种激发依赖特性是由于碳点和溶剂之间的相互作用所导致，这从原理上违背了卡莎规则。首先，在碳点吸收光子后会发生两个过程，即振动弛缓和溶剂弛缓；其次才是荧光发射，其中的溶剂弛缓过程由溶剂性质所决定。这种快速的溶剂化会导致分子在荧光衰减前完全弛豫，随后产生不同能量的发射，进而产生激发依赖性，具体机制如图3A所示。Arshad等［18］发现随着溶剂极性的增加，碳点的荧光发射峰发生明显移动。通过对碳点的发光机制进行探究发现，边缘带和附着在边缘上的表面基团对荧光发射峰移动有所贡献，但氢键对激发态无稳定作用，而主要来源于电子跃迁。进而得出结论，碳点的溶致变色现象的产生主要由溶剂的偶极/极化效应引起，这种作用可以更好地稳定激发态，而对基态几乎无影响，从而使发射发生红移。

图3 CDs的各种荧光现象的动力学方面的示意图［17］（A）；所制备的CDs的能态和电子跃迁过程的示意图［19］（B）；分子态和溶剂之间相互作用导致的氢键诱导的CDs发射机制示意图［19］（C）；CDs在H2O和CCl4中的G带位置（D）和D/G峰积分强度比的变化（E）［21］；CDs的内部形态图，展示了含氯溶剂分子和发光中心之间的相互作用［21］（F）；密度泛函理论（DFT）在不同模型CDs上的计算结果［22］（G）；CDs中有助于观察到的发射和溶剂化过程的示意图［23］（H）Fig.3 Schematics of the dynamical aspects of various fluorescence phenomena of CDs［17］（A）. Schematic of the energy states and electron transition process for the asprepared CDs［19］（B） . Schematic of the HB effect dominating the CDs emission mechanism between molecule states and solvents［19］（C）. The change of the G band position（D） and D/G peak integral intensity ratios of CDs（E）in H2O and CCl4［21］. Scheme of the inner morphology of CDs which demonstrates interactions between the Cl-containing solvent molecules and luminescent centers［21］（F）. Density functional theory（DFT） calculation results on different model CDs［22］（G）.Sketch of the processes in CDs that contribute to the observed emission and solvatochromism［23］（H）

溶剂和碳点之间的特殊相互作用会对碳点的发射产生进一步的影响。碳点的结构中包含高度碳化的核和外部包覆的聚合物链或者官能团，这种结构因素导致碳点对周围环境响应时的反应位点主要集中在其表面。Zhang 等［19］制备了一种氮掺杂碳点，通过对其在16 种溶剂中的光物理参数、光谱行为和溶剂特性的关联性分析，发现碳点在质子性溶剂和非质子性溶剂中具有不同的响应现象，作者通过研究发现该碳点的氨基可与溶剂分子形成氢键，促进内转换效应，导致谱峰发生移动，从而影响碳点的发光寿命和效率（图3B、C）。此外，徐抒平等［20］也通过测量氮掺杂碳点和未掺杂的多种光物理参数，并借助Lippert-Mataga 模型和Kamlet-Taft 参数揭示了质子性溶剂中存在的氢键对碳点发光的影响。评估了氢键供体和受体对氢键效应的贡献比例，分析了氮元素掺杂在碳点溶致变色效应中的重要作用，给出了许多溶剂敏感碳点的光物理参数。

以上研究认为碳点溶剂响应的发光特性主要来源于表面态，但最近的一项研究表明溶剂分子也可以进入到碳点内部，影响碳点中的碳核结构。Stepanidenko等［21］通过对柠檬酸和乙二胺合成的碳点的光学性质进行研究。发现在吸收带和荧光发射带内可以分解出一组窄峰，通过对水中（高极性）和四氯化碳（低极性）中碳点的拉曼光谱进行测定，发现碳点在不同极性溶剂中的拉曼光谱响应行为有所差异，这与含氯溶剂与碳核的相互作用有关。因此，他们认为含氯的溶剂会穿透碳点进入内层，进而导致发光中心之间的距离增加，从而影响碳点的发光（图3D~F）。

碳点自身形成的微观分子结构也会影响其极性敏感特性，Wang等［22］制备了两种具有极性敏感特性的碳点。通过对比实验发现由邻苯二胺合成的碳点表现出微弱的荧光发射（QY 约为2.8%~6.1%）和39 nm 的溶致变色位移。相反，由邻苯二胺和4-氨基苯酚所合成的碳点则显示出更高的溶致变色位移（87 nm）和发光量子产率（QY 约为18.4%~32.5%）。通过对合成的两种碳点的结构、组成进行分析，验证了碳点的极性敏感特性来源于吡咯氮和氨基氮的形成，并通过密度泛函理论计算进行了证实（图3G）。

上述列举的4种发光机制或者影响因素并非单独作用，其存在一定的协同效应。Reckmeier 等［23］通过分析碳点在水和DMSO 溶剂中的吸收、发光、寿命等光谱信息研究了氮掺杂和氮硫共掺杂碳点中的极性敏感特性。结果表明，碳核态、边缘带和表面官能团均会参与其中，共同影响碳点的发射（图3H）。

2.2 极性敏感碳点的应用

得益于碳点优异的发光特性，极性敏感碳点在细胞成像和细胞内极性传感领域取得了诸多进展。郑州大学李朝辉教授课题组［24］发展了多种极性敏感碳点。如图4A所示，2021年，该课题组通过对对苯二胺结构进行改进，利用N-苯基-苯二胺作为前驱体合成了一种新型的极性敏感碳点。其具有强烈的分子内电荷转移特性，对溶剂极性表现出灵敏的响应，在1，4-二氧六环和水中的荧光强度差异可达到509 倍。细胞成像结果显示该碳点可以定位在细胞内的溶酶体中，并能监测饥饿条件下溶酶体的极性变化。借助于这种探针，他们首次监测了斑马鱼伤口愈合过程中极性的动态变化，为评价伤口愈合程度奠定了基础。2022 年，该课题组继续通过改进苯胺结构前驱体，以2-甲酰苯硼酸频哪酯作为改性剂，合成了一种可对极性实现超敏感响应的碳点。该碳点的特殊之处在于不仅其荧光强度与极性之间存在线性关系，且其最大发射波长也与极性存在线性关系，可实现对细胞内的极性评估。他们使用成像设备中的原位发射光谱对脂滴和细胞质中的极性变化进行双色成像定量分析，揭示了脂滴的极性异质性和细胞质中的极性均匀性，并对癌细胞和正常细胞进行了区分［25］（图4B）。该课题组2022年又通过6-氨基苯并［c］［1，2］氧杂硼杂环戊-1（3H）-醇盐酸盐和酒石酸合成了一种具有极性和粘度双敏感的溶酶体靶向碳点，该碳点具有水溶性好、发射不受pH依赖、生物相容性好和光稳定性优异的优点，可以根据癌细胞内溶酶体微环境极性较低、粘度较高的特征区分癌细胞与正常细胞，在癌症诊断领域具有广阔的应用前景［26］。徐抒平等［27］通过N，N-二乙基对苯二胺溶剂热合成出了一种新型发光碳点，该碳点具有明显的溶致变色特征，对溶剂的极性变化极为敏感。得益于上述特性，该团队将此碳点应用于细胞内脂滴的成像，并通过其极性响应特性测量了细胞内脂滴簇的极性（图4C）。

图4 对极性敏感的PPh-CDs的合理设计以及CDs在监测斑马鱼截肢过程中极性变化的应用［24］（A）；脂滴和细胞质成像示意图［25］（B）；CPDs的合成及其在脂滴成像中的应用示意图［27］（C）Fig.4 Rational design of the polarity-sensitive PPh-CDs and the use of the CDs in monitoring polarity changes during amputation of zebrafish［24］（A）. Schematic representation of the lipid droplets and cytoplasm imaging with different emission windows and high-fidelity detection of polarity by in situ emission spectrum［25］（B）. Schematic diagram of synthesis of CPDs and their applications in lipid droplet imaging［27］（C）

3 粘度敏感型碳点

3.1 粘度敏感碳点的响应机制

粘度为扩散过程中的一个关键参数。在生物系统中，黏度影响着有机体和细胞水平上的各种生物活动，如细胞内的粘度影响着生物体代谢水平、细胞间信号的转导以及生物大分子之间的相互作用。在亚细胞器水平，多种细胞器也受周围粘度微环境的影响，进而产生各种各样的生理过程变化。另外，包括脉粥样硬化、阿尔茨海默病在内的多种疾病也均与粘度的异常相关。

粘度敏感碳点的研究目前尚处于初步探索阶段，在设计粘度敏感碳点时通常需参考小分子荧光探针中的分子转子理论。粘度敏感碳点在特定波长的激发下，通过分子内旋转失去活性，通常情况下量子产率较低。但在高粘度环境中，分子转子受周围介质粘度的影响而转动受限，失活过程则主要转变为荧光发射，从而导致在高粘度介质中荧光发射增强。Guo 等［28］通过前驱体设计，选择柠檬酸和1-苯基吡咯烷作为反应物，使其高温高压下发生Friedel-Crafts 反应形成碳点。该探针利用柠檬酸所含的羧基和羟基，脱水碳化形成碳核；利用吡咯烷基高温碳化后残留在碳点表面作为分子转子官能团，两者互为补充。该粘度敏感碳点可响应溶剂粘度范围为0.89~945 cP（图5A、B）。Jing 等［29］通过飞秒瞬态吸收光谱探究了粘度对于碳点溶剂化弛豫过程的影响，结果表明在粘度较高的溶液中，溶剂和碳点之间具有更强的摩擦作用，影响溶剂化弛豫过程，进而影响发光（图5C~F）。但由于关于粘度敏感的碳点报道有限，其响应机制是否可以通过小分子荧光团的敏感机制被揭示？是否会由于自身特殊的结构因素带来更为复杂的粘度敏感响应机制？这些问题都有待于进一步研究。

图5 CDs的合成路线和随着粘度增加而增加的CDs的荧光强度［28］（A）；使用CDs通过荧光变化和位置切换同时监测线粒体粘度动力学和MMP［28］（B）；CDs相对于溶剂粘度的重新定向排列时间［29］（C）；计算的结构（D）和不同模式的能级（E）；N和O掺杂CDs的吸收、溶剂化弛豫、受激发射和激发态吸收过程的模型［29］（F）；溶酶体靶向和区分癌症细胞和正常细胞的CDs合成途径和传感模型［26］（G）Fig.5 Synthetic route of CDs and turn-on fluorescence of CDs with increasing viscosity［28］（A）. Illustration of simultaneous monitoring of mitochondrial viscosity dynamics and MMP through fluorescence variation and location switching using the CDs［28］（B）.Reorientation times for CDs versus viscosity of solvents（C）.Calculated structures（D） and energy levels of different modes（E）.Model of absorption，solvation relaxation，stimulated emission，and excited state absorption processes in N and O-doped CDs［29］（F）. Synthetic route and sensing model of the CDs for lysosome targeting and distinguishing between cancer cells and normal cells［26］（G）

3.2 粘度敏感碳点的应用

粘度敏感碳点的应用相对少，仅限于细胞内的粘度传感。Xiao等［26］制备了一种新型粘度/极性双响应溶酶体靶向碳点，实现细胞免洗荧光成像，用于癌细胞和正常细胞的区分（图5G）。Guo 等［28］设计了线粒体靶向粘度碳点，建立了线粒体膜电位与粘度的关系，阐明了两者之间的相互作用。该研究发现在线粒体膜电位正常的活细胞中，碳点聚集在线粒体中，而当线粒体膜电位消失时细胞死亡，此时的碳点则聚集在核仁中，通过荧光信号的变化以及碳点的空间位置实现线粒体粘度和线粒体膜电位波动的检测。研究中还观察到在药物刺激的细胞中线粒体表现出粘度增加并伴随膜电位减少的现象，这为线粒体相关生物学效应的研究提供了有价值的信息（图5A、B）。

4 温度敏感型碳点

4.1 温度敏感碳点的响应机制

温度是一个基本的热力学参量。细胞内中众多生物过程均受到温度的影响，癌症、炎症等疾病均和细胞内温度的异常相关。目前已经开发出多种新型发光材料用于温度的传感，包括量子点、稀土掺杂发光材料、MOFs等。碳点的温度敏感机制还不具备完备的温敏解释理论。部分学者结合碳点的发光机制将其温敏特性归因于表面态的非辐射通道的热激活效应。在低温情况下，非辐射通道未被激活，因此可以通过辐射光子发射荧光。相反，随着温度的升高，更多的非辐射通道被激活，激发的电子通过非辐射过程回到基态，导致荧光强度降低。

Yu等［30］在2012年首次报道了碳点温度依赖荧光发射的特性，并将其与半导体纳米颗粒的温敏性质进行比较。通过时间相关单光子计数技术（TCSPC）测量了碳点在不同温度下的荧光寿命，发现在温度较高时，其非辐射衰变速率较快，从而导致更快的发光弛豫过程。此外，通过对于光谱峰的指认发现其中两类特殊的荧光峰（高能带和低能带峰）与温度并不相关，推论电子-电子散射效应是碳点产生温敏效应的来源（图6A~C）。Kalytchuk 等［31］通过将样品的辐射跃迁和非辐射跃迁常数与碳点的荧光量子产率相关联，通过探究碳点的温度依赖吸收特性绘制了辐射跃迁和非辐射跃迁常数与温度的关系，结果发现非辐射跃迁常数随着温度的增加持续上升，而辐射跃迁常数却在此温度范围内变化不大，该实验证实了温度对于非辐射跃迁的影响大于辐射跃迁。Guo 等［32］发现温度除了影响碳点的非辐射跃迁过程外，还显著影响其辐射捕获效率。为了证实这一点，作者将荧光强度和阿伦尼乌斯公式相关联，描绘了热活化能和荧光强度的关系，并阐述了辐射和非辐射重组率与温度的关系，进一步证实了在温度上升时，碳点非辐射速率提高的现象，表明了碳点的温敏特性是非辐射弛豫通道的激活和辐射捕获效率变化双重作用的结果（图6D）。

图6 CDs的两个发光位点：核心（带Ⅰ）和表面（带Ⅱ）［30］（A）；CDs的荧光强度与两个波段温度的拟合关系［30］（B）；作为温度函数的550 nm下的时间分辨荧光光谱测量［30］（C）；ln［（I0/IT）-1］对1/kT Cys-CDs溶液的依赖性［32］（D）；CDs在20°C和80°C水溶液中的紫外-可见吸收光谱［34］（E）；CDs在80°C水溶液中的TEM图像，尺寸增加到（4.4±0.2）nm［34］（F）；dCD孵育的HeLa细胞在不同温度下的荧光显微图像［37］（G）Fig.6 Two luminous sites of CDs：core（bandⅠ） and surface（bandⅡ）［ 30］（A）. Fitting relationship between CDs PL intensity and temperature of two bands［30］（B） . Time-resolved PL measurements at 550 nm as a function of temperature［30］（C）. The dependence of ln［（I0/IT）-1］ on 1/kT Cys-CDs solution［32］（D）. UV-Vis absorption spectra of CDs in aqueous solution under 20 and 80 ℃［34］（E）. TEM image of CDs in aqueous solution at 80 °C and the size increased up to（4.4 ± 0.2） nm［34］（F）.Fluorescence microscopy images of dCD incubated HeLa cells at the different temperatures［37］（G）

除了利用热力学相关理论和光物理参数外，研究者也尝试其他手段探究碳点的温度敏感行为。He等［33］通过测量不同温度下碳点的水合半径，发现随着温度的提高，碳点的粒径不断增加，表明温度会导致碳点的聚集，从而影响发光。Wang等［34］也通过透射电子显微镜（TEM）观测到温度发生变化时，碳点粒径增加的现象（图6E、F）。Yang 等［35］通过利用强还原剂硼氢化钠对碳点表面进行处理，由氧化态变为还原态。还原后消除了碳点表面较多的羰基官能团，碳点表现出荧光减弱、温敏程度降低的趋势，他们将这一现象归因于碳点表面官能团对温敏特性有所贡献。通过将固态碳点分散在不同介质中的碳点的荧光行为进行对比，发现固态碳点仍能保持荧光性质，但温敏特性几乎消失。而分散在乙醇中的碳点相较于分散于水中的碳点也表现出不灵敏的温度响应，这一现象归因于氢键的作用。

4.2 温度敏感碳点的应用

温敏碳点常被应用于细胞及活体温度传感领域，并开发了多种模式的传感探针，包括强度依赖型、荧光寿命依赖型、荧光比率型等。

Wang等［36］通过溶剂热处理合成了8种新型碳点，并选取了温度敏感性能最好的Y-CDs实现了对溶液温度的精确识别。这种碳点具有良好的温敏循环性和再现性，可分布在细胞质和细胞核中，辅助荧光共聚焦显微镜观察细胞温度改变。Kalytchuk 等［31］建立了碳点的荧光寿命和温度之间的关系，通过矫正曲线对细胞内每次测量的温度进行确定。基于该碳点的温度敏感探针检测结果与参考探针的测试结果吻合度良好，可通过荧光寿命的变化指示细胞内的温度差异。Macairan 等［37］通过碳点发展了一种比率型纳米温度传感探针，通过蓝色和红色通道成像HeLa细胞在不同温度下的荧光强度建立比率型温度探针。该荧光探针不受测试条件、碳点浓度变化的影响，展现了良好的应用前景（图6G）。

5 结论与展望

环境敏感性碳点作为一种智能型碳纳米材料，表现出巨大的应用潜力。本文汇总了近年四类环境敏感型碳点的响应机制及其在生物传感研究中的最新进展，以期为设计和合成更易调控、高敏感的环境敏感型碳点提供参考。在环境敏感型碳点发光机制探究方面仍需要大量的研究投入和探索。目前大多数报道是通过对照实验或者通过响应前后产物的结构分析推演出的经验规则，大多仅适用当下实验，较难成为普适性的碳点设计原则。建立更贴合实际的理论模拟模型和方法，对其形成过程、响应过程进行探究，将有助于进一步理解碳点的形成机制和响应机制。此外，建立多种碳点原位的结构分析技术，以及对环境响应过程的原位跟踪和解析，将有助于我们理解其发光机制和调控机制。

目前，领域内关于碳化聚合物点的具体发光机制问题尚未形成统一认识，相信随着研究的不断深入，碳化聚合物的理论体系会逐渐完备，最终形成具有普适性的发光理论体系，完善的发光机制也将极大地促进环境敏感碳点在胶体界面、药物分析、生物治疗和生物代谢物示踪等方面的应用。环境敏感型碳点可以应用于胶体界面领域。表面活性剂在超过临界胶束浓度（CMC）后可以形成微胶束，而CMC 前后胶束的亲水亲油性质会发生显著改变。环境敏感型碳点可以感知周围环境的油/水环境改变，从而影响其发光行为，使得其可以实现CMC 的传感和测量，进而实现微胶束形成过程的动态表征。在生物应用方面，环境敏感型碳点可以响应细胞/体内不同酸碱性及极性的微环境，从而影响碳点的发光和响应行为，实现生物体内微环境的成像和光谱模式的传感及测量。更进一步，细胞/体内的微环境也可以影响碳点以及碳点和药物复合物的行为，而实现生物局部敏感及特异性的靶向给药，有望在生物诊疗领域具有一定的应用价值。