提高移植光感受器功能性整合的策略

王俊 综述 陈亦棋 沈丽君 审校

1浙江大学医学院附属第二医院眼科,杭州 310003;2浙江省人民医院眼科,杭州 310014

视网膜退行性疾病,如年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)和以视网膜色素变性为代表的遗传性视网膜疾病等,通常是由光感受器功能的障碍和丧失导致的[1]。尽管不同疾病之间光感受器受损的机制不同,但最终结局是相同的,即大量光感受器丢失,造成视力不可逆的损害[2]。目前,除了湿性AMD可以利用抗血管内皮生长因子得到一定治疗外,大多数视网膜退行性疾病还无法得到有效的控制。

光感受器移植是一种颇有前景的再生策略,旨在替换已丢失的光感受器,并重新与内层视网膜剩余神经元建立连接[3],在一定程度上恢复视网膜的光敏性。这一策略要求视网膜下间隙的移植细胞迁移入宿主外核层,与宿主双极细胞形成突触,同时发育出对光敏感的外段与宿主视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)层紧密接触,通过不断的膜盘脱落和更新,以及视色素再生来维持光感受器的结构和功能[4-5]。

在2016年的3项研究中,研究人员通过分别标记细胞质和细胞核的实验方法发现,在光感受器移植后,主要发生物质交换--即移植细胞将细胞质所含蛋白质/RNA等转移至宿主残余的光感受器内,实现对宿主细胞的治疗作用,而发生细胞整合的比例相对较低[6-8]。这种物质交换的主要特点包括:宿主和移植细胞间的物质交换双向进行;以一种短暂但频繁的方式进行,不需要持续的相互作用;与细胞外蛋白、核酸的摄取以及细胞的融合无关;似乎仅限于光感受器间[6-8]。虽然物质交换的发生机制尚不明确,但其功能发挥的前提是视网膜内有足够的剩余光感受器,因此这一机制更适合用于早期退行性疾病,在晚期显然需要细胞整合才可发挥作用。

2018年,Waldron等[9]将视锥前体细胞分别移植入视网膜结构紊乱且外界膜结构受到破坏的Nrl-/-小鼠和引入保护基因后结构紊乱较小的Nrl-/-RPE65R91W/R91W小鼠,结果显示结构紊乱的视网膜整合事件发生的比例达到23%,而结构完整的视网膜中该比例仅为6%。这证明了宿主环境影响2种机制的相对贡献,提示整合事件发生的比例可通过调控来提高[9]。

而除了整合事件比例不足外,移植光感受器还存在其他问题,包括细胞在移植后表现出取向(即光感受器外段朝向RPE层,突触端朝向外核层)能力不完全,外段发育不成熟以及突触形成不足等。为了提高光感受器的功能性整合,可选择合适的移植细胞群、对宿主环境进行一定程度的干预、改变细胞移植的形式以及优化视网膜下注射等方式。下面分别从这些方面进行介绍。

1 移植细胞群的选择

有关移植细胞群选择的相关小鼠研究已取得较为一致的结果。基本的实验思路是通过观察不同视网膜发育阶段的特定细胞群移植至宿主小鼠的结果,来确定最佳的移植细胞群。对于小鼠视杆细胞的移植,产后第4～7天分离的视杆前体细胞群最适合移植,而对于视锥细胞的移植,胚胎第15.5天的细胞群最佳[10-12]。上述时间段分离的细胞代表了有丝分裂后的光感受器前体细胞,与宿主视网膜的相互作用最强。虽然实验结果显示发生物质交换事件更多,但是证实了视网膜发育过程中确实存在着最适合的移植时间窗[1,12]。在这期间,未成熟光感受器可能会再现与视网膜内层细胞突触形成的发育程序[2]。

在人类胎儿视网膜中,视锥细胞和视杆细胞的发生分别从妊娠第8周和第10周开始[13]。然而,由于获取胎儿视网膜的资源有限且不符合伦理要求,近几年的研究使用人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cell,hiPSC)和人胚胎干细胞(human embryonic stem cell,hESC)来源的视网膜类器官获得移植光感受器。通过转录组分析发现,视网膜类器官与胎儿视网膜发育的时程及细胞组成大体相似[13-15]。近年来,人源性细胞移植的部分研究显示,供体细胞群主要来源于分化第60～90天的视网膜类器官,大多通过绿色荧光蛋白分离并富集[4,16-19];也有研究选取分化第120天的类器官并通过细胞标志CD73+来富集[20];最新的一项研究显示,来源于视网膜类器官的光感受器仅在早期存在短的发育时间窗,能发生典型的轴突延伸,而到了类器官分化第80天,只有极少数细胞能够自主生长轴突[21]。这些细胞的共同特征是均为光感受器前体细胞。移植结果显示,虽然迁移至外核层的细胞数量少,但以整合的形式为主,细胞表现出一定的取向,同时有突触蛋白的表达、原始膜盘的形成等,主要以组织学的改善为主[4,17,18,20];也有研究显示视功能的恢复[16]。使用比较成熟的细胞群移植,整合细胞的数量会减少,移植比较不成熟的细胞群,物质交换似乎更频繁[22-24]。这些研究所选择的宿主不同,但宿主环境同样会影响移植结果,因此结果的解释需综合考虑。总之,无论是动物源性还是人源性移植细胞,与宿主的相互作用均受供体细胞发育阶段调节,人类最佳的移植细胞群还需要进一步研究证实。

与通过干细胞得到光感受器不同,最新的研究显示使用5种化合物:丙戊酸、CHIR99021、RepSox、Forskolin以及STR(Sonic hedgehog,taurine and retinoic acid),可绕过诱导生成多能干细胞的步骤,直接使小鼠成纤维细胞转化为化学诱导的光感受器样细胞[25]。将上述细胞移植入视网膜退行性变小鼠(rd1)模型,显示出功能学及组织学的改善[25]。该过程极大地缩短了获得移植光感受器所需时间,具有很大潜力,但是未来需要克服增生能力及转换效率低的缺点。

2 宿主环境的干预

影响供体光感受器在宿主环境中迁移的主要屏障包括外界膜,反应性胶质增生和细胞外基质蛋白。此外,对宿主环境进行免疫调节,也可提高整合的发生。

外界膜构成外核层与视网膜下间隙的天然屏障[1,22]。有多项实验研究显示,动物模型中外界膜的破坏与移植光感受器整合提高相关[9,12,26]。利用胶质毒素α-氨基己二酸[27-28]或靶向外界膜成分的小干扰RNA[29],可破坏外界膜。然而其在人体内使用需考虑毒性影响及脱靶效应[1]。Ripolles-Garcia等[30]研究者将人光感受器前体细胞移植入遗传性视网膜疾病犬模型视网膜下,发现接受免疫抑制剂治疗突变犬的外界膜发生局部破坏,移植细胞轴突延长并形成类似于突触终端结构。因此外界膜可作为未来研究的一个靶点,以期提高移植效果。

视网膜发生退行性变后,进入视网膜重塑阶段。Müller细胞首先发生反应性胶质增生,表现为胶质纤维酸性蛋白及波形蛋白的表达上调,细胞肥大及突起数量增加,形成可能会阻碍细胞迁移和整合的屏障[22,25,31]。移植C-Kit+祖细胞群至退行性变视网膜中可观察到胶质增生受抑制,提示可选择或培养同时具有再生光感受器及改善移植微环境能力的供体细胞群[24]。

此外,活化的星形胶质细胞和Müller细胞会上调细胞外基质蛋白的分泌。硫酸软骨素蛋白多糖作为主要的分泌蛋白,其沉积可能会抑制宿主双极细胞树突再生以及供体细胞轴突延长[32],与外核层中整合细胞数量呈负相关[26]。利用软骨素酶ABC可切割硫酸软骨素蛋白多糖的糖胺聚糖侧链来提高整合结果[33];此外,利用基质金属蛋白酶2也可通过消化细胞外基质提高细胞迁移[34]。

Zhu等[16]指出退行性疾病环境中巨噬/小胶质细胞的浸润,可能影响组织修复。巨噬/小胶质细胞有2种激活形态:与导致组织损伤、炎症发生有关的M1型;与炎症消退及组织修复有关的M2型[35]。因此,通过免疫调节,使M1型转化为M2型,则可能改善免疫微环境,促进细胞整合。中脑星形胶质细胞源性神经营养因子可促进巨噬/小胶质细胞转化为M2型,作用于退行性变视网膜后,改善了移植细胞的整合及视觉功能的恢复效果[36]。此外,部分研究发现米诺环素、干扰素β、转位蛋白及合成孕酮[35,37-39]等药物具有抑制视网膜内小胶质细胞迁移或激活的作用,然而目前尚无利用这些物质调节细胞移植的相关研究。最近有一项研究指出小胶质细胞在视网膜下间隙的浸润反而有利于延缓退行性疾病进展[40]。因此,未来还需要进一步阐明调节小胶质细胞与改善宿主移植环境之间的关系。

3 视网膜片的移植

移植含光感受器的视网膜片,相较于细胞悬液的形式,具有以下优势:(1)改善了细胞的生理微环境[2];(2)提高了移植细胞的组织性、存活率及整合效率[1];(3)提高了视网膜片外段的成熟能力[4]。然而,视网膜片移植后普遍形成“玫瑰花结”,影响光感受器的外段与RPE层接触[41]。此外,移植片中其他视网膜细胞的存在可能会限制突触连接的形成。

随着视网膜类器官技术的不断成熟,利用人源性类器官进行视网膜片移植的研究开始逐渐增多。与细胞悬液移植不同,视网膜片大多数细胞为视网膜祖细胞时表现最佳[23]。近年来,高桥政代团队将视网膜祖细胞时期的hESC源性视网膜片,移植至免疫缺陷rd1小鼠模型(NOG-rd1-2J)后,发现视网膜片表现出成熟的内、外段形成和突触接触的迹象,且记录到视网膜神经节细胞反应[42]。此外,该团队将分化第50～60天hiPSC源性视网膜片移植到视网膜退行性变的免疫缺陷大鼠模型[SD-Foxn1 Tg(S334ter)3LavRrrc]和激光诱导退行性变、低剂量环孢素免疫抑制的猴模型内,结果显示移植物在大鼠中存活10个月,在猴眼内存活超过2年。移植区的组织学显示,光感受器发育成熟,极性正确,突触形成;在功能方面观察到大鼠的视网膜神经节细胞反应改善,猴眼中与移植区相关的视野试验轻度恢复[43]。类似地,McLelland等[44]将分化第30～65天hESC源性视网膜片移植至同种大鼠模型,观察到光感受器明显发育,宿主视网膜与移植片之间建立了活跃的突触,视动测试及上丘电生理记录显示出功能改善。

与利用类器官作为供体不同,Lorach等[45]将健康成年大鼠包括RPE层在内的全层视网膜作为供体,分别移植入RCS及S334ter-3大鼠视网膜下,结果显示移植区域光感受器的内外段保存完好,移植物与宿主间形成突触,同时RPE层互相融合。因而该研究提出将患者周边视网膜移植入中央视网膜下,可治疗AMD等疾病。然而,视网膜不同区域细胞组成及结构存在较大的差异,且患者自身细胞可能存在缺陷,因此该研究治疗方案的有效性尚待证实。另一项视网膜外植体研究也显示活性RPE层可增强光感受器的有效整合,而受损的RPE层在一定程度上会限制整合[46]。上述研究结果提示可发展光感受器与RPE层的共同移植,以及视网膜下手术时尽量避免损伤RPE层。

4 生物材料的支持

利用生物支架可将纯化的光感受器前体细胞有序地进行排列,保持细胞的正确取向及组织,同时支架更利于移植手术时精确定位于靶点,兼具细胞悬液及视网膜片的优势。

基于此,Jung等[47]通过微模塑技术,利用聚二甲基硅氧烷及聚(丙三醇-癸二酸)材料,得到大量“高脚杯”状支架紧密排列形成的高分子膜。“高脚杯”的“杯身”用于容纳1～3个光感受器的细胞体,“杯柄”用于延伸轴突,透射电镜显示内段富含线粒体。该研究团队进一步利用可生物降解的聚癸二酸甘油酯(poly glycerol sebacate,PGS)制作了“冰格状光感受器托盘”,将移植细胞种植的密度提升了3倍,同时在底部设计了圆柱状的孔隙,以便与受体的视网膜组织相连并逐渐成熟,该生物支架能提供光感受器发育初期必要的机械强度,且能够实现移植后材料的代谢[48]。在后续研究中,此团队开发了一款蜂窝状,可生物降解的PGS视网膜微支架,能有效地支持高密度的RPE和光感受器细胞层在支架上的生长,从而形成排列紧密且规则的双层视网膜细胞[48]。然而,这些研究未将所开发的支架植入动物模型中,因此其有效性待进一步验证。

此外,利用双光子光刻技术可实现生物支架精细结构的3D打印,分辨率可达50 nm[49-50],完全满足光感受器植入的需要。该技术制作的支架可成功支持hiPSC源性视网膜祖细胞生长,将空支架置入Pro23His视紫红质突变猪模型后一个月,未引起炎症、感染或局部及全身毒性[50]。除了利用生物支架提高移植光感受器的组织性外,也有研究通过模拟视网膜细胞外基质的支架促进视网膜祖细胞分化[51],或是利用生物材料提高供体细胞的迁移能力[52],或优化细胞移植的载体提高细胞的存活率及整合效率[27,53]。最近一项关于视网膜下间隙注射的研究发现,将不同大小的微胶珠注射至视网膜下间隙,6小时后1 μm微胶珠在此间隙内数量减少,而在巩膜外腔内增多;而1～2周后视网膜下间隙仍有较多4 μm微胶珠存在[54]。该研究提示使用生物材料作为输送细胞的载体,除了某些成分本身可提高细胞存活率外,使用这些载体可能通过增加移植物体积来减少细胞被排出视网膜。

5 视网膜下注射的优化

既往研究中经视网膜下注射细胞或视网膜片多数采用经玻璃体入路,少数研究经脉络膜上腔入路。经玻璃体入路注射针头必须穿透视网膜,可能会导致视网膜局部胶质增生[22],而且注射细胞容易反流至玻璃体,造成移植细胞的损失及潜在的风险[55]。而经脉络膜上腔入路注射后玻璃体内基本不会出现移植的细胞,但是技术相对复杂,容易损伤脉络膜及血管,可能导致免疫细胞进入视网膜[22]。因此需要对手术入路选择进行权衡。此外可通过改良输送工具来保护移植细胞或视网膜片,借助术中眼底成像技术及手术机器人实现精确定位,减少注射相关损伤。

另外,Scruggs等[56]发现,注射前将细胞置于37 ℃孵育,注射时使用尺寸较大的针头,可提高移植细胞的存活率。Wilson等[55]也发现使用尺寸较小的针头会导致细胞死亡增多,移植入无效的细胞碎片。Scruggs等还发现注射时针头尺寸增大会导致RPE细胞异常的增加,主要表现为脱色素及RPE65标记表达丢失,而宿主RPE层损伤会减少光感受器的有效整合[45,56]。增加移植物粘滞度、控制注射速度在较低水平,可减少RPE异常的发生,这可能与湍流效应的减轻有关[56]。评估及优化注射相关流体动力学的参数,将有助于减轻注射对宿主环境的影响;利用生物材料作为载体也可能通过增加移植物粘滞度,来改善细胞整合。

6 总结与展望

光感受器移植作为治疗视网膜退行性疾病的有效方法,还面临着许多未解决的难题。本文就移植后功能性整合效率低下的问题总结了部分有助于改善该现象的策略。此外,Garita-Hernandez等[4]将干细胞移植与光遗传学的方法相结合,在供体光感受器内导入视蛋白,人为地赋予其光敏性,再移植入退行性变小鼠视网膜内。在不形成外段及不依赖RPE的情况下,移植小鼠视功能得到明显的提高。这种绕开对功能性外段生成以及视色素循环需求的研究方案也有巨大的潜力。

在未来,可继续寻求改善移植的不同策略:利用转录组学等技术确立最佳的人源性细胞群;研究改善退行性变视网膜环境的干预方法及临床转化;评估及优化视网膜下手术相关的不同参数;探究含移植细胞的生物支架在不同动物模型内的治疗作用;发展更有竞争力的生物材料;将光遗传学改造的光感受器植入生物支架进行移植研究。总之,提高移植光感受器与宿主视网膜间功能性整合具有广阔的前景,却也是再生医学领域的技术难点,多种学科之间的合作将有助于推动其发展。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突