灵芝孢子油体内外抗氧化作用研究

向世东,张广磊,周功强,黄文康,陈 浩,俞 浩*

1.安徽科技学院食品工程学院,安徽凤阳,233100;2.固镇金叶养殖家庭农场,安徽固镇,233700;3.亳州学院中药学院,安徽亳州,236800

灵芝(Ganodermalucidum)为多孔菌科植物赤芝或紫芝的干燥子实体,既可用于药用,亦可用于食用,古有“仙草”之称,是一种传统的补品[1]。据《神农本草经》记载,灵芝有“强筋骨、抗衰老、补中益肝肾”之功效。灵芝栽培广泛,主要分布于亚洲东部地区,在我国主要分布于长江以南高温多雨地区。

灵芝孢子油(GanodermalucidumSpore oil,简称GLSO)主要提取自灵芝孢子,属于一种油状物质,其主要生理活性包括抗肿瘤、增强免疫力、保护肝脏、抗氧化和延缓衰老等,作为保健食品日益受到人们的重视,具有较好的开发利用前景[2-3]。GLSO主要活性成分为不饱和脂肪酸、甘油酯、萜类、甾体类、维生素等,是GLSO发挥生理功效的物质基础[4-6]。Zhang等[7]采用果蝇模型评价灵芝孢子油的生物学效应,发现在正常条件和氧化应激下均可延长果蝇平均寿命,并显著提高其抗氧化酶活性。胡瞬等[8]也证实在D-半乳糖衰老小鼠模型上,GLSO能够有效地增加小鼠血清中SOD和CAT活性。上述试验表明,GLSO可以起到抗氧化和延缓衰老的作用。然而,其有效成分GLSO抗氧化能力具体作用机制研究鲜有报道。因此,试验通过体内外两个水平探讨GLSO的抗氧化作用及其具体作用机制,为GLSO的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

SPF级昆明种小鼠60只,雌性,4～6周龄,体重(20±2)g,购自江苏华创信诺医药科技有限公司,动物质量合格证编号:NO2023042002,动物生产许可证号:SCK(苏)2020-0009。

1.2 药材与试剂

灵芝孢子油,黄山云乐灵芝有限公司;维E软胶囊,浙江医药股份有限公司;维生素C,天津大茂化学试剂厂;DPPH、ABTS,美国sigma公司;NBT、PMS、NADH、D-半乳糖,上海麦克林生化科技有限公司;SOD、MDA、CAT、总蛋白(TP)试剂盒,南京建成生物工程研究所;PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT抗体,美国CST公司;HPR标记的IgG二抗,英国Abcam公司;β-actin、BCA试剂盒、ECL发光试剂盒,生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 仪器与设备

ME55型分析天平(成都一科仪器设备有限公司);XMTD-7000型恒温水浴锅(上海科恒实业发展有限公司);UV-1900i型紫外分光光度计(岛津企业管理中国有限公司);MS3型旋转混匀器(德国IKA公司);TGL-20M型台式高速离心机(湖南湘仪离心机仪器有限公司);JXCL-6K型冷冻研磨仪(上海净信实业发展有限公司);DYY-6C型电泳仪(北京市六一仪器厂);ZD-9556型水平摇床(太仓市科教仪器厂);SHZ-82型气浴恒温振荡器(上海汗诺仪器有限公司);Spectra Max iD3型酶标仪(美谷分子仪器有限公司)。

1.4 方 法

1.4.1 GLSO体外抗氧化作用研究

DPPH清除测试:将配制好的各浓度溶液取2.0 mL,添加DPPH(0.2 mmol/L)溶液2.0 mL,黑暗处静置30 min,517 nm处测定吸光值[9],按式(1)计算:

DPPH清除率/%=[1-(A1-A2)/A0]×100

(1)

其中,A1、A2、A0分别表示样品、对照、空白溶液的吸光值。

ABTS清除测试:参考文献[10]配制ABTS工作液,将配制好的各种浓度溶液取0.1 mL,添加ABTS溶液3.9 mL,黑暗处静置5 min,734 nm处测定吸光值,按式(2)计算:

ABTS清除率/%=[1-A1/A0]×100

(2)

其中,A1、A0分别表示样品、空白溶液的吸光值。

(3)

其中,A1、A2、A0分别表示样品、背景、空白溶液的吸光值。

1.4.2 动物分组及给药

参考文献方法[12-13],将60只小鼠适应性饲养1周,按体重随机分为正常组(Normal组),模型组(D-gal组),维E组(VE组),灵芝孢子油低(GLSOL)、中(GLSOM)、高(GLSOH)剂量组,每组10只。除Normal组外,其余组腹腔部位注射D-半乳糖120 mg/kg(0.1 mL/10g体重)以构建小鼠衰老模型;Normal组注射等体积生理盐水,Normal组和D-gal组灌胃相同量植物油作对照。VE组灌胃100 mg/kg的VE;GLSO组分别灌胃200、400、800 mg/kg的GLSO(0.1 mL/10g体重)。各给药组在灌胃前均采用植物油配制相应的浓度,1次/d,持续7周。每周称量小鼠体重1次以调整灌胃、注射剂量。

1.4.3 血清及肝组织SOD、CAT、MDA含量测定

试验第7周末,小鼠禁食12 h,采集血液并制备肝组织匀浆,按试剂盒说明书测定各指标含量[14]。

1.4.4 Western blot检测衰老小鼠肝组织蛋白表达

取小鼠肝组织剪碎加到液态氮中研磨,再放入离心管中充分裂解,进行离心处理。通过BCA法定量并提取总蛋白,进行凝胶电泳、转膜、5%脱脂奶粉室温封闭1 h。将一抗按1∶1 000的比例进行稀释并孵育过夜,然后进行每次3 min的TBST洗膜5次。添加HRP标记的二抗(1∶5 000),室温下孵育2 h,TBST重复洗膜5次,ECL发光试剂盒显色。以β-actin作参照物,运用图像处理软件对目标蛋白的相对表达量进行分析。

1.5 数据处理

2 结 果

2.1 DPPH清除率

如图1所示,在0.2～1.0 mg/mL浓度范围内,GLSO对DPPH的清除效果逐渐提高。浓度为1.0 mg/mL时,GLSO和VC都表现出最大清除效果,清除率分别为(81.75±1.26)%和(97.26±1.05)%。此时,GLSO的清除能力相当于VC的84.05%,表明GLSO对DPPH具有较强的清除能力。

图1 DPPH清除率

2.2 ABTS清除率

如图2所示,在0.2～1.0 mg/mL浓度范围内,GLSO对ABTS清除效果不明显。浓度为1.0 mg/mL时,对ABTS清除能力达到饱和状态,清除能力最高可达(21.45±1.2)%,此时,GLSO的清除能力相当于VC的22.05%,表明GLSO对ABTS具有一定的清除能力。

图2 ABTS清除率

图3 ·O-2清除率

2.4 对衰老小鼠血清生化指标的影响

与Normal组相比,D-gal组小鼠血清SOD和CAT值显著降低(P<0.01),MDA显著升高(P<0.01);与D-gal组相比,GLSOM、GLSOH组小鼠血清SOD和CAT值显著升高(P<0.05,P<0.01),GLSOM、GLSOH组较D-gal组MDA显著降低(P<0.05,P<0.01),见表1。

表1 小鼠血清生化指标检测结果

2.5 对衰老小鼠肝组织生化指标的影响

与Normal组相比,D-gal组小鼠肝组织SOD和CAT值显著降低(P<0.01),MDA显著升高(P<0.01);与D-gal组相比,GLSOM、GLSOH组小鼠肝组织CAT值显著升高(P<0.05,P<0.01),GLSOH组较D-gal组SOD值显著升高(P<0.01),GLSOM、GLSOH组较D-gal组MDA显著降低(P<0.05),见表2。

表2 小鼠肝组织生化指标检测结果

2.6 对衰老小鼠肝组织PI3K/AKT通路的影响

与Normal组相比,D-gal组小鼠肝组织p-AKT/AKT和p-PI3K/PI3K比值显著降低(P<0.01);GLSOM、GLSOH组较D-gal组小鼠肝组织p-AKT/AKT和p-PI3K/PI3K比值显著升高(P<0.05,P<0.01),见表3。

表3 小鼠肝组织PI3K/AKT通路蛋白检测结果

3 讨 论

PI3K/AKT通路是一种重要的细胞信号传导通路,参与调控多种病理生理过程。该通路在细胞增殖、存活、分化以及代谢调控方面发挥关键作用[21]。在多种器官和组织中,PI3K/AKT通路显示出显著的抗氧化功能,对细胞的氧化应激具有重要的保护作用[22]。Sha等[23]以麦芽酚为研究对象,对D-半乳糖衰老小鼠模型研究结果表明激活PI3K/AKT通路可以改善氧化应激损伤。有研究认为随着年龄的增长MDA水平升高,SOD、CAT抗氧化酶活性降低,继而导致活性氧(ROS)增加,引发氧化应激反应,ROS的过量产生可以反向调节PI3K/AKT通路[24-25]。试验结果显示,与模型组相比,GLSO各剂量组能够不同程度提高p-AKT/AKT和p-PI3K/PI3K比值,表明GLSO可能通过激活PI3K/AKT通路调节细胞增殖,抵抗肝脏细胞氧化应激反应。

综上所述,GLSO能够清除自由基提高机体抗氧化能力,对衰老小鼠有保护作用,其作用机制可能通过调控PI3K/AKT通路实现的,但试验关于其上下游蛋白调控机理,有待进一步研究。