猪捷申病毒云南流行株的遗传进化*

蔡懿琳，朱培英，柴 俊，宋春莲，杨莎莎，武 鑫，张以芳，李文贵

(云南农业大学 动物医学院，云南 昆明 650201)

猪捷申病毒(porcine teschovirus，PTV)属于小RNA 病毒科肠道病毒属的一员，最早发现于20 世纪30 年代的捷克斯洛伐克捷申地区，当时病死率高达80%以上。PTV 的传染源为病猪和带毒猪，感染猪在临床明显期甚至潜伏期都具有传染性。该病毒主要存在于病猪脑脊髓中，但在感染后几周内可随唾液和粪便等排出[1]。即使是外观正常、特别是4 周龄以上的猪，其体内也可分离到该病毒，说明健康猪也普遍存在带毒现象，而强毒株可引起暴发流行[2]。迄今为止，在家猪中检出的 PTV 血清型包括PTV1～PTV12，在野猪中还检出了PTV13，共计 13 种血清型毒株[3-5]。猪是PTV 唯一的宿主，且各年龄的猪均易感，其中幼龄猪的易感性最高，哺乳仔猪感染PTV 后，死亡率高达100%；而3 周龄以上的猪感染PTV则存在隐性感染。病毒随粪便排出体外，排毒量大，排毒时间可长达数周[6]。中国是世界生猪养殖第一大国，猪肉产量不仅与中国养猪行业的经济效益息息相关，也与人们的日常生活密不可分。2003 年在中国内蒙古首次分离到PTV，命名为Swine/CH/IMH/03，属于PTV1 血清[7]；随后，陆续在中国的黑龙江、吉林、河南、江苏、上海、广西和湖南等地的猪场检出PTV，说明该病已在中国猪群中蔓延开来[8-10]，而云南鲜有关于PTV 的研究报道。为了解云南省猪群的感染情况，本研究参考GenBank 上已收录的基因序列，针对猪PTV 5′-UTR 部分基因片段设计1 对引物，对云南部分猪场的粪便样品进行检测，通过扩增片段的同源性分析，阐明云南地区PTV 流行株的遗传特性，为制定科学的防控措施提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2020 年6 月—2021 年12 月，从云南省曲靖市、弥勒市和大理州的3 个猪场共采集117 份猪粪便样品，按1∶5 (m∶V)加入无菌生理盐水振荡混匀，反复冻融3 次，再以10 000 r/min 离心5 min，取上清液于—50 ℃冻存备用。

1.2 主要试剂与仪器

Trizol 总RNA 提取试剂、EasyPure Quick Gel Extraction Kit、2×EasyTaqPCR SuperMIX 和RNA Dissolving Solution 购自北京全式金生物技术有限公司；Goldview Ⅱ型核酸染色剂购自北京赛百盛基因技术有限公司；PrimeScriptTMIV 1st strand cDNA Synthesis Mix、DL2000 DNA Marker、pMD-19-T Vevtor Cloning Kit 和大肠杆菌DH5α Competent Cells 购自宝日生物工程有限公司；IPTG和X-Gal 购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3 引物的设计与合成

参考GenBank 上登录的PTV 基因组全长序列进行序列比对，选取5′-UTR 非编码区部分基因保守区域，通过Primer 5.0 生物软件设计1 对特异性引物 (F：5′-GAAGAGCAAGTACTCCTGAC-3′；R：5′-YAGCRCAAGTCCAGTCCT-3′)，产物长度为125 bp，由北京擎科生物科技有限公司昆明分公司合成。

1.4 试验方法

1.4.1总 RNA 提取

采用Trizol 法抽提样本中的总RNA，取上清液300 μL，加入Trizol 1 mL，剧烈混匀，静置(裂解) 5 min。加入氯仿200 μL，盖上离心盖，剧烈混匀10 s，静置3 min，4 ℃、10 000 r/min 离心15 min；取上清液500 μL 转移至新的无菌无酶EP 离心管(注意不吸到中间的蛋白质层)，加入异丙醇0.5 mL，上下颠倒混匀；常温下静置10 min，4 ℃、10 000 r/min 离心10 min，弃上清液后加入75%乙醇1 mL，剧烈涡旋，4 ℃、7 500 r/min离心5 min，倒掉乙醇，倒置在干净的滤纸上，用吸水纸擦干管壁，吹风干燥；加入RNA Dissolving Solution 50 μL 溶解沉淀(即RNA)，后于—80 ℃冰箱保存备用。

1.4.2cDNA 合成及目的基因扩增

反转录总反应体系为20 μL，包括5×Prime-Script IV cDNA Synthesis Mix 4 μL，50 μmol/L Random 6 mers 2 μL，模板 RNA 8 μL，RNase Free dH2O 6 μL；反应条件为30 ℃ 10 min，42 ℃15 min。PCR 扩增总反应体系为25.0 μL，包括2×EasyTaq®PCR SuperMix (+dye) 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，无核酸酶水 8.5 μL，cDNA 2.0 μL；反应条件为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，32 个循环，72 ℃延伸7 min。

1.4.3目的基因回收以及基因克隆与鉴定

扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳110 V、40 min 检测并观察结果。挑选片段大小正确的阳性PCR 产物，用凝胶快速回收试剂盒回收并纯化；回收产物与pMD19-T 载体连接2 h 或过夜，再转化至DH5α 感受态细胞进行蓝白斑筛选；挑选白色菌落接种于含氨苄青霉素(100 mg/mL)的LB 液体培养基中，置于37 ℃摇床振荡培养过夜；以菌液为模板配制PCR 体系，采用琼脂糖凝胶电泳对PCR 产物进行鉴定。提取阳性菌液的质粒，送至上海生工生物工程股份有限公司昆明分公司测序。

1.4.4阳性序列分析及遗传进化树构建

从GeneBank 中选择19 条PTV1～ PTV13 参考序列，并以1 株猪萨佩罗序列(MN685785)作为出群参考，采用DNAstar 软件分析核苷酸序列的同源性；采用MEGA 7.0 软件的邻接法分析并绘制系统发育树，自举检验(bootstrap)取值1 000。本研究获取的序列用“▲”表示，系统发育树中其他地区分离的PTV 毒株序列用“GenBank 序列号-PTV 血清型-分离国家”表示。

2 结果与分析

2.1 RT-PCR 扩增结果

RT-PCR 扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，可见约125 bp 的目标条带(图1)。117 份粪便样品中有阳性样品32 份，阳性率为27.3%。

2.2 系统进化分析

阳性样品经测序、比对和去除重复序列后获得6 条序列。经分析，分离株间的核苷酸同源性为93.2%～98.9%；与19 株PTV 参考序列的核苷酸同源性为89.7%～100.0% (图2)。系统发育树结果(图3)显示：YNDL-2 和YNDL-3 处于同一分支，与中国四川省2018 年分离的PTV3 毒株亲缘关系较近；YNQJ-1 与日本2016 年分离的PTV1毒株处于同一分支，亲缘关系较近；YNDL-1、YNQJ-4 和YNQJ-5 聚为一簇，株间核苷酸序列相似度为97.7%～98.9%，与2010 年分离自多米尼加的PTV1 毒株亲缘关系较近。说明同一猪场可能存在不同的PTV 基因型，但未体现出明显的地域差异；YNDL-1、YNQJ-4 和YNQJ-5 的序列相似度和系统发育分析说明该PTV 毒株可能在传播过程中发生了部分基因突变。

图2 PTV 5′-UTR 部分基因的核苷酸同源性分析结果Fig.2 Nucleotide homology analysis results of partial PTV 5′-UTR gene

图3 PTV 部分5′-UTR 基因序列的系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree based on the partial PTV 5′-UTR gene

3 讨论

自1929 年PTV 首次在捷克斯洛伐克捷申地区被发现至今已近百年，该病现已成为世界范围流行的猪传染病，危害养猪业的健康发展。PTV 的主要传播方式是直接接触传播和粪口传播，也可通过呼吸道黏膜、眼结膜和生殖道感染猪群[11]，猪只跨省调运或冷链运输是该病潜在的风险因素。资料表明：在2 ℃储存6 周的真空包装猪肉中仍可检出PTV[12]。2003 年，中国哈尔滨兽医研究所首次从内蒙古分离到第1 株PTV，随后全国各地陆续检出该病毒。徐国栋等[8]对江苏、黑龙江、上海、吉林、广西和河南等地2007-2016 年PTV 流行病学数据进行汇总发现：该病毒阳性率最高达57.14% (52/91)，平均阳性率为28.05% (274/977)；本研究27.3%的流行强度为近年来国内报道的平均水平。

目前PTV 检测方法有免疫电镜技术、间接ELISA、胶体金技术以及RT-PCR 技术等，其中酶联免疫吸附试验(ELISA)和RT-PCR 是最常用的检测方法。由于PTV 高度变异，设计通用检测引物难度大[13]，本研究通过比对GenBank 近年收录的PTV 群基因组序列，通过对保守基因(5′-UTR)部分片段设计引物，建立的RT-PCR 检测方法不仅具有特异性强、耗时短和检出率高等优点，而且较荧光PCR 成本更低，适合猪场大批量样品核酸检测。本研究通过PTV 核酸特异性扩增和测序，经同源性比较与系统进化树分析发现：大理同一猪场同时存在PTV3 和PTV1 感染，曲靖某猪场流行的毒株则均为PTV1，说明PTV1在云南省猪场较为常见，同一猪场同时存在多种流行型毒株。本研究的样品来源于无异常临床表现的猪只新鲜粪便，但PTV 核酸阳性率高达27.3%，表明PTV 在猪群中的隐性感染现象较为普遍。考虑到本研究的样本量有限，应在全省范围内开展系统流行病学调查，掌握PTV 的流行情况及风险因素。

PTV 在猪场的流行越来越普遍，其对猪只健康的影响急待明确。在江西猪场，PTV 感染保育猪可出现发热和瘫痪等症状[10]；云南兰坪县[14]和马龙区[15]等地猪场观察到PTV 感染仔猪出现高热、惊厥、死亡和腹泻等为主的临床症状。PTV还可与CSFV、PRRSV 和PCV2 等重要病原混合感染[16-17]，使猪场疫病更加复杂，增加防控工作难度[18]。目前已有研究更多关注猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)和猪瘟(CSFV)等重要传染病，而PTV 多呈亚临床感染，往往被养猪行业忽视。值得注意的是，作为小RNA 病毒的PTV 已发现13 种血清型，血清型间致病性差异较大，加之该病毒变异性强，有必要对其开展流行病学调查以及致病机制和免疫机理等基础研究，评估其对中国养猪业构成的潜在威胁，提前做好技术储备。

本研究用于分析的PTV 5′-UTR 片段较短，得出的结论存在一定局限性，仅可为云南省PTV流行情况及毒株遗传进化差异性提供参考。在下一步工作中，将对PTV 其他编码区域的基因片段进行扩增，并对扩增片段进行氨基酸突变位点和基因重组分析，预测其蛋白二级结构和磷酸化位点，深入研究扩增片段在PTV 遗传进化中的作用。此外，将通过细胞攻毒培养的方式，对云南流行的优势毒株进行分离鉴定，并进行深入研究，探究其致病机理及其与宿主细胞的互作关系，为PTV 的疾病防控和疫苗研发提供数据支撑。

4 结论

针对猪捷申病毒(PTV) 5′-UTR 保守区域设计了1 对检测引物，并对云南省曲靖、弥勒和大理部分猪场采集的样品进行RT-PCR 检测，PTV 阳性率达27.3% (32/117)。6 条流行毒株扩增序列的株间核苷酸同源性为93.2%～98.9%，与19 株PTV参考序列的核苷酸同源性为89.7%～100.0%，表明流行株间遗传进化关系差异较大，同一猪场存在不同基因型的病毒感染，但区域流行性不明显。