生长因子促进牙源性间充质干细胞对疾病治疗的研究进展

姜禾 金可欣 陈怡彤 吴江源 雷张辰 汪淑华*

迄今为止，已有多种牙源性间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）从具有外胚间充质来源的牙齿和牙周组织中分离出来，主要包括牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）、脱落乳牙干细胞（stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHED）、牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）、根尖乳头干细胞（stem cells from apical papilla，SCAP）、牙囊干细胞（dental follicle stem cells，DFSC）、唾液腺干细胞（salivary gland stem cells，SGSCs）等。研究表明［1］，牙源性MSCs 可以与生长因子产生协同作用，使疾病的干细胞治疗产生更好的效果，此类以组织工程学为基础的疾病治疗方式，已成为目前的研究热点。本文对联合生长因子的牙源性MSCs 治疗的研究进展作如下综述。

1 口腔疾病的干细胞治疗

1.1 颌骨缺损修复

1.1.1 表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF） EGF 可通过高亲和力结合细胞表面的表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）并提高内在蛋白酪氨酸激酶活性而发挥作用。EGFR 的激活可启动信号转导级联反应，调节细胞分化、增殖、迁移和侵袭等多种生物学功能［2］。作为EGF 的重要组成部分，上皮调节蛋白（epiregulin，EREG）可由人颗粒细胞在促炎细胞因子前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）的诱导下合成，并进一步激活MAPK 通路［3］，EREG可以通过激活MAPK 信号通路促进DPSCs 成骨/牙本质分化，促进缺损颌骨的修复。然而另一项研究表明，EREG 可以通过p38 MAPK 和ERK 信号通路抑制DPSCs 的成骨/牙本质分化潜能，在炎症环境下，EREG 耗竭能改善p38 MAPK 和ERK 的表达并增强DPSCs 的骨/牙本质分化潜能［4］。EREG作用浓度的不同可能是造成其在不同研究中产生不同效果的原因。EGF 作为细胞分化的诱导剂具有诱导方法简单、无毒的优点［5］。但目前关于EGF 对MSCs 成骨分化的确切作用机制仍未得到详细阐明，不同EGF 浓度、加入EGF 的时机、不同EGF 家族成员、MSCs 培养过程等都可能通过影响EGFR的活化程度来影响MSCs 成骨分化，并进一步影响缺损颌骨的修复程度，为了保证调节作用的安全性、稳定性、持久性，其具体机制还有待进一步研究。

1.1.2 促红细胞生成素（erythropoietin，EPO） EPO 是一种能加速MSCs 募集的重要生长因子，其具备多种方式改善MSCs的成骨分化，包括通过增加细胞因子的表达，以及调节核因子-κB 配体信号传导的受体激活因子等［6］。EPO 可以通过增加细胞增殖、迁移和分化的方式诱导MSCs 的成骨［7］。EPO可以通过p38 MAPK 的磷酸化增强PDLSC 中的骨形成，此过程中成骨基因Runt 相关转录因子2（runt-related transcription factor 2，RUNX2）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和骨钙素（osteocalcin，OCN）的表达有所提高［6］。EPO 治疗可促进颌骨在骨折期间的愈合，但是在健康动物中给药时则会导致骨丢失［8］。此外，高剂量的EPO（50U/ml）会使细胞活力下降［9］，对于其给药浓度也有待进一步研究。

1.1.3 胰岛素样生长因子 胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）是一种多功能肽，对骨骼生长、修复和重塑起到关键的调节作用［10］，其中一种多肽生长因子（即IGF-1）是IGF 轴中最重要的成员［11］。IGF-1 可以显著促进DPSCs、SCAP、PDLSCs 等多种牙源性MSCs 的成骨/牙本质分化［11］。在早期成骨和晚期成骨的阶段，IGF-1 都可以通过MAPK 通路上调ALP、OCN、RUNχ2和Osterix 蛋白（osterix，OSX）的表达，促进PDLSCs 的成骨分化［10］。此外，IGF-1/IGF-1R/hsa-let-7c 轴也可以通过调节JNK 和p38 MAPK 信号通路来控制IGF-1 处理的SCAP 的成骨分化。IGF-1R 不仅可与IGF-1 结合发挥作用，其本身也可以调节干细胞分化［11］。然而，全身应用IGF-1 可能在一定程度上导致癌症发病率的增高［12］。

1.1.4 转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β） TGF-β 是一种与膜内骨形成联系密切的多功能细胞因子，具有调节成骨细胞分化、骨折修复、骨骼发育以及细胞外基质合成的作用［13］。其中TGF-β3 在TGF-β 家族中占据重要的地位，已在体内用于修复颌骨、再生组织和愈合伤口，同时还能促进基质形成和维持牙源性MSCs 的特性［3］。TGF-β3 可激活特异性Ⅰ型、Ⅱ型受体并与之相互作用，将信号传导至细胞内，激活胞内的转化生长因子活化激酶1（transforming growth factor activated kinase 1，TAK1），并由此进一步激活MAPK 激酶3/6（MAPK kinase 3/6，MKK3/6），磷酸化的MKK3/6 又能激活下游的p38 MAPK，后者可直接进入细胞核，上调成骨相关基因RUNχ2的表达，促使牙源性MSCs成骨分化［1］。已有研究证实，TGF-β3 能通过p38 MAPK 通路诱导PDLSCs 和DPSCs 的成骨分化［3］。TGF-β 与骨形态蛋白联合后，双向调控成骨细胞分化的作用会更加持久，TGF-β不仅可作为理想细胞因子应用于软骨组织工程，也可以通过软骨内骨化途径促进颌骨修复，在未来的临床应用中具有广阔的前景。

1.1.5 成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF） FGF 是一系列在各种生物学过程中具有旁分泌、自分泌和内分泌功能的蛋白质［14］。有研究表明，经碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）处理激活的ERK1/2 信号可抑制WNT/β- catenin 通路，降低MSCs 标志物基质细胞抗原1（stromal cell antigen 1，STRO-1）、CD146、CD73 和CD90 的表达水平，导致SHED 的成骨缺陷［15］。然而，bFGF 与IGF-1 协同作用时则可正向刺激MSCs 的增殖和分化，促进颌骨的重建修复［16］。对于FGF2，其既可以作为正调节因子促进成骨，也可以作为负调节因子抑制成骨。作为正调节因子时，FGF2 可通过JNK 信号通路促进人牙髓来源的MSCs 的成骨分化，也可通过ERK 和骨形态发生蛋白信号通路促进MSCs 的分化［17］。FGF-21 通过多调信号通路保持机体的骨稳态［18］，而FGF-23 则在调节维生素D、磷酸盐和钙代谢过程中发挥关键作用，其代谢轴对骨骼健康的维持和全身矿物质的平衡具有重要作用［19］。但是，较低浓度的FGF-21 和FGF-23 可能与妊娠期糖尿病的病理生理有关，其虽然不是妊娠期糖尿病的基本因素，但仍可能对妊娠期机体的代谢造成不利影响［20］。

1.1.6 血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF） VEGF 是骨形成和愈合过程中调节血管生成的关键生长因子，其在骨整合中有两个作用：增强血管生成和响应Ti 表面特性在成骨细胞样细胞成熟中的自分泌/旁分泌作用［21］。在骨折或骨缺损区域，VEGF 通过参与新生血管的形成，趋化MSCs 向损伤区域集合并产生成骨分化，修复缺损的颌骨［22］。使用VEGF 的靶向补充剂来预防或治疗临床上存在的颌骨愈合缺陷时，将需要临床证据来证明VEGF 水平与骨骼健康之间的强关联，以及更好地了解在其他生长因子、干细胞和骨基质蛋白合成的背景下VEGF 如何发挥作用。

1.2 牙周组织再生 由菌斑微生物引起的牙周病常导致牙齿松动、脱落，慢性牙周炎是常见的牙周病之一，会引起的骨和结缔组织损伤，并抑制机体的成骨作用。治疗此类牙周组织破坏性、炎症性疾病的最终目的是实现牙周的重建与再生。牙源性MSCs 可达成高效、低风险修复牙周组织的目的，与靶组织也高度相似。而TGF-β、bFGF 等生长因子可促进干细胞的增殖和分化［23-24］。因此，由生长因子介导的牙源性MSCs 治疗，有着广阔的应用前景，有望成为牙周组织重建与再生的一种新型治疗策略。然而，目前如FGF2 等生长因子在体内的半衰期较短，注射3d 后在注射部位仅存留不到10%，还需要更多临床实验研究，实现牙周再生的长期高效治疗［23］。

1.3 牙髓再生 研究表明，多种生长因子可促进MSCs 的迁移、增殖、分化，治疗牙髓炎、牙髓坏死导致的牙髓丢失，促进组织再生［25］。具体解释为，根管冲洗后，牙本质将释放VEGF-A、VEGF-D、TGF-β1、TGF-β2 等11 种生长因子至根管［26］，牙源性MSCs 在生长因子的引导下得以激活。研究证实，生长因子其既可以加速内源性干细胞向受伤部位的募集，进而改善再生能力，也可以促进外源性移植干细胞向受体组织动员和植入，从而促进牙髓再生［24］。但是，目前已实现的牙髓组织再生仅局限在牙髓牙本质样结构、血管样结构的再生，并未实现牙髓对应生物学功能的重建［27］。如何实现牙髓结构和功能的完全再生，仍亟待探索和解决。

1.4 免疫调节 NAKAO 等［28］表明，牙龈组织来源的MSCs 在肿瘤坏死因子-α（tumour necrosis factor-alpha，TNF-α）处理的条件下，外泌体得以表达CD73，这将进一步诱导M2 巨噬细胞极化，使得牙周炎消退，牙周再生增强。OGASAWARA 等［29］证实，SHED 中含有包括IGF、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）等在内的51 种阵列蛋白，其可抑制炎症反应、细胞凋亡，促进软骨层的增殖和基质沉积，修复骨关节紊乱，最终得以治疗颞下颌关节炎。OGATA 等［30］研究认为，DPSC 可通过减少炎症细胞因子表达，以TGF-β 途径诱导脾脏中的调节性T 细胞（regulatory T cell，Treg）控制局部炎症微环境，抑制细胞凋亡，改善由干燥综合征引起的唾液分泌过低。

由此可得，在牙周炎、颞下颌关节炎、干燥综合征等炎症微环境中，适宜的牙源性MSCs 和生长因子的预处理有助于形成良性的免疫调节，抑制炎症反应带来的不良影响。然而，MSCs 的体外和体内研究结果存在一定差异，如何找到体内外的细胞活动机制的共性仍有待进一步研究［31］。

2 全身疾病的干细胞治疗

相较于其他MSCs，牙源性MSCs 具有更强的自我更新和多向分化潜能，同时因其免疫原性低、取材创伤小等诸多优势，已被认为是全身组织再生的理想干细胞来源。已有大量研究证实，结合生长因子的牙源性MSCs 治疗，可应用于脊髓损伤［32］、阿尔兹海默症［32］、帕金森症［33］、视网膜退行性疾病［34］、糖尿病［35］等疾病。

在科学技术和生物材料进一步发展的大背景下，基于其优秀的干细胞性能和临床应用价值，牙源性MSCs 治疗全身性疾病将迎来更广阔的应用前景。但是，可溶性生长因子和外泌体的生物属性和具体分子机制仍未得到系统全面的阐述，对其进行更深刻的了解是加快其使用统一、技术普及并应用于全身治疗的必要条件。

3 小结与展望

目前，牙源性MSCs 应用于各种组织损伤性疾病的前景较为广阔。然而，当前生长因子的收集过程步骤复杂，收集所得的浓度和含量也往往较低，无法达到最佳的治疗效果。此外，生长因子对牙源性MSCs 的作用条件仍未得到系统阐述，对其作用机制的研究也尚不完善，使用不当可能造成肿瘤、骨丢失等不良后果。目前，干细胞移植的应用范围也较狭窄，对牙源性间充质干细胞和生长因子进行更深入的探究是了解其对再生医学的功效程度的先决条件，希望未来此项技术能得到更多的研究，并在临床上得到更全面完善的应用。