肿瘤标志物及EMT通路表达水平对黑色素瘤预后的影响

王 倩

(空军军医大学第二附属医院皮肤科,陕西 西安 710038)

黑色素瘤是一种源于黑色素细胞的高度恶性皮肤肿瘤[1],我国每年新发患者超过8 000例。黑色素瘤的发生与人体的遗传基因、免疫系统、环境因素等多种因素有关[2]。黑色素瘤的治疗主要包括手术切除[3]、放射治疗、化疗、免疫治疗等[4]。手术切除是最常见的治疗方式,早期发现并及时切除,患者的治愈率较高。但黑色素瘤是病死率较高的一种恶性肿瘤,具有较高的转移潜能[5]。复发和转移是患者死亡的主要原因,近年来对黑色素瘤转移和侵袭机制的深入研究,很大程度上提高了患者的生存率。

肿瘤细胞发生上皮-间充质转化(EMT)被认为是癌症转移的起始和关键步骤之一[6]。EMT是上皮细胞在特定病理生理条件下转换为在形态学上具有间充质表型细胞的过程,其发生会导致细胞黏附和机械性能的显著改变,包括细胞间连接破坏、细胞骨架重组和细胞运动性增加[7]。因此,细胞力学特性在肿瘤进展中起着关键作用。近年来,基因检测技术的应用能帮助医生识别黑色素瘤的高危患者,也有助于接受靶向治疗患者的“对症用药”和预后评估[8]。然而,基因检测花费较高并且受到地区医疗条件限制,多数患者无法进行检测。本研究采用生物信息学分析,探究常规黑色素瘤肿瘤标志物表达与EMT通路的关系,为识别和随访高转移风险的黑色素瘤患者提供新思路。

1 资料与方法

1.1资料来源 从TCGA数据库下载黑色素瘤患者肿瘤组织的转录数据、蛋白表达数据和对应的临床数据。为黑色素瘤确诊患者,共472例,其中男293例,年龄18～90岁,平均(57.91±15.38)岁;女179例,年龄15～90岁,平均(58.56±16.25)岁。样本纳入标准:经病理证实为黑色素瘤,具有完整的临床预后数据。经过分析后共461例黑色素瘤患者纳入研究。

1.2方法

1.2.1EMT相关通路对于预后的影响 通过GSEA网站(https://www.gsea-msigdb.org/),以“Melanoma EMT”为检索词进行搜索,最终下载EMT相关基因集ALONSO_METASTASIS_EMT_UP(EMT相关通路),其中包含相关基因35个。使用R语言中的GSVA包对每个样本的表达进行非参数的无监督分析,最终得到EMT相关通路的表达评分。根据评分的中位数将样本分成高、低两组,并使用Survival包进行生存分析。

1.2.2肿瘤标志物的mRNA与EMT相关通路的相关性 提取黑色素瘤患者肿瘤标志物mRNA表达水平,包括S100A1、PMEL、MLANA、TYR、MITF及MKI67。并将其与每个样本对应的EMT相关通路的表达评分进行Spearman相关性分析。随后根据年龄、性别和肿瘤分期进行上述相关性的亚组分析。

1.2.3不同表达水平的肿瘤标志物与EMT相关通路对预后的影响 分别根据S100A1、PMEL、MLANA、TYR、MITF和MKI67的中位数将样本分成高低两组,在各组中使用Survival软件包分析EMT相关通路对预后的影响。然后,再根据EMT相关通路评分将样本分为两组,分别探讨上述肿瘤标志物表达水平对预后的影响。

1.2.4肿瘤标志物的蛋白表达水平与EMT相关通路的相关性 从TCGA数据库下载黑色素瘤患者肿瘤标志物的蛋白表达水平,获得具有蛋白表达数据的样本352例。将蛋白表达数据与样本的EMT相关通路评分进行合并,获得转录组数据和蛋白表达数据能对应的样本343例。最后将肿瘤标志物蛋白表达水平与每个样本对应的EMT通路的表达评分进行Spearman相关性分析。

1.3统计学处理 本研究中的统计分析使用R软件(4.2.3)完成,Spearman相关性分析计算肿瘤标志物的表达水平和EMT通路的相关性;Kaplan-Meier 曲线比较肿瘤标志物不同表达水平及EMT通路与肿瘤总生存期的差异;P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1EMT相关通路对预后的影响 根据EMT通路表达评分的中位数将样本分成高低两组(图1A);生存分析结果显示,EMT相关通路的高表达预示黑色素瘤患者的不良预后(P<0.05),见图1B。

注：A.黑色素瘤组织EMT相关通路中基因的表达;B.EMT相关通路高表达组预示不良预后。

2.2肿瘤标志物的mRNA与EMT相关通路的相关性 Spearman相关性分析结果表明,S100A1、PMEL、MLANA、TYR及MITF与EMT通路呈负相关(P<0.05),而MKI67与EMT相关通路呈正相关(P<0.05),见图2。

图2 常见肿瘤标志物的mRNA表达水平与EMT通路的相关性

2.3肿瘤标志物mRNA与EMT相关通路的亚组分析 分别按年龄(≤65岁和>65岁)、性别(男和女)、分期(0～Ⅱ和Ⅲ～Ⅳ)将样本分成两组,在各组中将2.2中的肿瘤标志物与对应的EMT通路的表达评分进行Spearman相关性分析,探究2.2中得到的结果在不同亚组中是否一致。结果表明,65岁及以下和65岁以上患者有一致的结果,即PMEL、MLANA、TYR、MITF与EMT通路呈负相关(P<0.05),而MKI67与EMT通路呈正相关(P<0.05);男性患者的结果与总样本所得结果一致,女性患者PMEL、MLANA与EMT通路呈负相关(P<0.05),MKI67与EMT通路呈正相关(P<0.05);0～Ⅱ期患者结果与总样本所得结果一致,Ⅲ～Ⅳ期患者PMEL、MLANA、TYR、MITF与EMT通路呈负相关(P<0.05),见表1。亚组分析结果与总样本中所得结果基本一致。

表1 肿瘤标志物mRNA水平与EMT相关通路相关性的亚组分析(r)

2.4不同表达水平的肿瘤标志物与EMT相关通路对预后的影响 结果显示PMEL高表达和EMT通路低表达时预后良好,见图3A、B;EMT相关通路低表达时MLANA高表达、MKI67低表达,预示预后良好(P<0.05),见图3C、D。

注：A.PMEL高表达时,EMT相关通路低表达预示着预后良好;B.EMT相关通路低表达时,PMEL高表达的患者可获得更好预后;C.EMT相关通路低表达时,MLANA高表达预示更好预后;D.EMT相关通路低表达时,MKI67低表达的患者可获得更好预后。

2.5肿瘤标志物蛋白表达水平与EMT通路的相关性 考虑到上述结果仅是mRNA与EMT通路的相关性,而临床上肿瘤标志物的检测常检测的是蛋白质。因此,进一步下载了黑色素瘤患者蛋白表达数据,并进行相关性分析。TCGA数据库中缺乏TYR和MKI67的蛋白表达数据,故进行了其他4种肿瘤标志物蛋白表达的分析。结果显示,PMEL、MLANA、MITF与EMT通路的表达呈负相关(P<0.05),见图4,与图2中对应的mRNA与EMT通路相关性结果一致。

注：A.S100A1蛋白表达水平与EMT通路呈正相关(P<0.05);B.PMEL蛋白表达水平与EMT通路呈负相关(P<0.05);C.MLANA蛋白表达水平与EMT通路呈负相关(P<0.05);D.MITE蛋白表达水平与EMT通路呈负相关(P<0.05)。

2.6影响恶性黑色素瘤预后的因素分析 单因素分析结果显示,PMEL、MKI67、EMT相关通路、年龄和病理分期是恶性黑色素瘤预后的影响因素。进一步将上述因素纳入多因素分析,结果显示PMEL、年龄和病理分期是恶性黑色素瘤预后的影响因素(P<0.05),见表2。

表2 肿瘤标志物mRNA水平和EMT相关通路的因素分析

3 讨 论

恶性黑色素瘤是一种恶性程度较高的肿瘤,起源于外胚层的神经嵴,常见于皮肤、眼葡萄膜、消化道、呼吸道和泌尿生殖道等部位[9]。黑色素瘤较强的转移、侵袭能力在其复发和转移过程中发挥着重要作用。而EMT是上皮细胞在特定病理生理条件下转换为在形态学上具有间充质表型细胞的过程[10],也是肿瘤转移、侵袭的重要机制。

基因检测的应用极大帮助了医护人员评估黑色素瘤患者的复发和转移风险,也有助于随访计划的制订。但因其应用也存在局限性[11],一是并非所有黑色素瘤患者均需要进行基因检测,二是基因检测的费用较高也限制了其推广,也给医护人员的随访带来一定困难。由于黑色素瘤患者大多会接受病理组织活检和(或)免疫组织化学(免疫组化)检测[12],因此作者想探究能否通过常见黑色素瘤肿瘤标志物的免疫组化结果来评估患者的复发和转移风险。本研究旨在了解EMT是否对黑色素瘤患者的预后存在影响,以及黑色素瘤肿瘤标志物是否与EMT存在相关性。

根据《黑色素瘤病理诊断临床实践指南(2021版)》[13],常用于临床诊断和预后判断的肿瘤标志物包括S100A1、PMEL、MLANA、TYR及MITF等。本研究分析了上述部分肿瘤标志物和EMT通路的相关性。结果显示,EMT通路的高表达预示着患者的不良预后,黑色素瘤肿瘤标志物PMEL、MLANA、TYR和MITF的mRNA表达水平与EMT通路呈负相关(P<0.05);MKI67的mRNA表达水平与EMT通路呈正相关(P<0.05)。由于TCGA数据库中蛋白表达数据有限,只发现PMEL、MLANA和MITF的蛋白表达水平与EMT通路的表达呈负相关,这与对应的mRNA水平与EMT通路的相关性一致。S100A1被认为灵敏度最高,既往也有研究者将其和酪氨酸酶用于黑色素瘤预后的判断[14]。S100A1与EMT的相关性研究较少,现有研究结果显示在头颈部鳞癌中与EMT呈正相关(P<0.05)[15];而本研究结果显示,S100A1与EMT通路相关性较弱。尽管PMEL对黑色素瘤预后是否具有价值还尚存争议,但本研究结果提示PMEL和EMT通路存在相关性,PMEL低表达可能预示黑色素瘤的高转移潜能,而PMEL高表达和EMT通路低表达时预示预后良好。HEENEN等[16]也报道MLANA蛋白的减少预示着黑色素瘤患者的不良预后;本研究提示EMT通路可能是其中一条途径,而EMT通路低表达时MLANA高表达也预示预后良好,这一结果与现有研究一致。MITF是黑素生成和黑素细胞发育的重要调节因子,有研究表明MITF的表达能促进局部增殖并抑制侵袭、炎症和EMT转化[17],MITF表达的缺失导致侵袭和EMT过程的增加,这与本研究一致,也提示MITF表达低的黑色素瘤患者EMT通路活跃,随访应注意远处转移的可能。MKI67是一种核蛋白,其在细胞周期的G1、S、G2和M期均有表达,但在静止期(G0)的细胞中不表达[18],故MKI67的表达水平可以反映细胞增殖的活跃程度,其在黑色素瘤中高表达预示预后不良[19]。本研究结果显示,MKI67与EMT通路呈正相关(P<0.05),当EMT低表达时MKI67高表达预示预后不良。年龄也是黑色素瘤转移和预后的重要因素,高龄患者远处转移发生更早并与不良预后有关[20]。另外,黑色素瘤的病理分期也是影响预后的关键因素,分期越高往往代表更差的预后[21]。本研究结果也显示,年龄和病理分期是影响黑色素瘤患者预后的独立危险因素。

本研究对 TCGA 中黑色素瘤患者常见肿瘤标志物的转录组数据、临床数据和蛋白表达数据进行了分析,最终发现PMEL、MLANA和MITF的mRNA和蛋白表达水平与EMT通路的表达呈负相关,而EMT通路表达低时PMEL高表达、MLANA高表达、MKI67低表达预示良好预后,并且年龄和病理分期也需考虑在内。多学科协作模式下随访管理中护士发挥着不可或缺的作用,本研究可能为主管护士识别和随访未接受基因检测的高危患者提供一定依据。