聂芙蓉, 郭良兴, 杨金金, 冯海博, 徐红蕊, 周亚星, 李梦云
(1.河南牧业经济学院动物科技学院,河南郑州 450046;2.河南省非常规饲料创新利用重点实验室,河南郑州 450046;3.河南农业大学动物医学院,河南郑州 450046)
黄秋葵(Okra,Hibiscus esculentus L.),属锦葵科秋葵属一年生草本植物,果实中富含粗蛋白质、氨基酸营养物质及多糖、黄酮类等活性组分(皇圆圆等,2019)。 黄秋葵收获后剩余的大部分青绿叶片及嫩枝粗蛋白质含量高, 特别是叶片中的叶黄素和β- 胡萝卜素含量较高, 是其他牧草的2 倍以上。 研究表明, 黄秋葵茎叶粉中粗蛋白质为17.47%、粗灰分为13.48%、粗纤维为10.9%、粗脂肪为7.08%、无氮浸出物为51.07%、叶黄素含量2370 mg/kg 左右, 具有较高的利用价值(侯冠彧等,2006)。如果将黄秋葵茎叶饲料化进行利用,不但能变废为宝,有利于生态环境的保护,也使难以处理的秋葵秸秆成为一种优质新型饲料, 有利于扩大饲料资源,降低养殖成本。 目前,研究主要集中在黄秋葵对蛋鸡生产性能和蛋品质的影响方面(张海文等,2017),关于黄秋葵茎叶在动物生产上的应用鲜见报道。因此,本研究拟选取黄秋葵秸秆作为材料, 研究肉兔日粮中添加不同量黄秋葵秸秆对其生产性能、血液生化指标、盲肠微生物多样性的影响, 筛选出黄秋葵秸秆在肉兔日粮中适宜的添加比例, 为黄秋葵秸秆作为饲料原料的利用提供一定的科学依据。
1.1 试验材料 黄秋葵秸秆为黄秋葵收获后剩余的大部分青绿叶片及嫩枝,购买于孟州市。将其60 ℃烘干,粉碎过60 目筛,测定常规养分及主要活性组分含量,测定参照贺建华(2020)和黄阿根等(2007)方法进行。 具体数据见表1。
表1 黄秋葵秸秆的营养组成(风干基础)
1.2 试验设计与试验动物 选用35 日龄体重相近、健康状态良好的伊普吕断奶肉兔80 只,随机分为对照组、试验组(4%组、6%组和8%组),每组5 个重复, 每个重复4 只兔。 对照组饲喂基础饲粮,试验组分别饲喂含4%、6%、8%黄秋葵秸秆的饲粮。 预试期7 d,试验期35 d。
1.3 试验日粮 肉兔日粮参考 《肉兔营养需要量》(NY /T 4049-2021) 饲养标准配制,试验各组饲粮组成及营养水平见表2。
表2 饲粮组成及营养水平(风干基础)
1.4 饲养管理 试验在济源阳光兔业科技有限公司祖代肉兔场进行。 试验前对兔舍及试验用具进行清洗, 熏蒸消毒, 火焰喷枪高温灼烧兔笼灭菌。 试验期间按照阳光兔业常规免疫程序免疫接种,30 d 接种二联疫苗, 之后每周1 次接种其他疫苗,直至4 次全部接种完成。 试验兔单笼饲养,试验所用的九号兔舍自然采光、通风,室温保持在6 ~9 ℃。 除每天下午3 点定时喂料外,其余时间不喂料,自由饮水。
1.5 测定指标及方法
1.5.1 生长性能测定 以重复为单位, 正式试验的第1 天和第35 天早晨空腹称重,用于计算平均日增重;每天收集料盒剩料并称重,根据饲喂投料量计算平均日采食量; 根据平均日增重和平均日采食量计算料重比。 每天观察记录所有试验兔的腹泻和死亡情况, 每只兔腹泻1 d 记为1 个腹泻只次,试验结束后计算各组的腹泻率。
腹泻率/%=[腹泻只次总数/(试验兔总头数×试验总天数)]×100。
1.5.2 血液生化指标检测 试验结束后, 从每个重复选取1 只平均体重接近且健康状况良好的肉兔进行屠宰,接取全血暂存于抗凝管内,随即利用全自动生化分析仪进行生化指标的检测。
1.5.3 盲肠菌群多样性分析 在无菌条件下,用眼科剪在盲肠闭合处开口, 将盲肠内容物采集到无菌的冻存管中,迅速投入液氮中,放置入-80 ℃冰箱中保存,用于微生物多样性检测。随后将样品送至武汉生物科技有限公司, 使用高通量测序技术对盲肠内容物进行16S rRNA 基因测序, 分析肉兔盲肠微生物菌群结构。
1.6 数据处理及统计分析 试验数据经用Excel 2016 软件初步处理后,采用SPSS Statistics25.0 进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏法多重比较检验, 试验结果以 “平均值±标准差”表示,以P <0.05 表示差异显著。
2.1 饲粮中添加不同比例黄秋葵秸秆对肉兔生长性能的影响 由表3 可知, 和对照组相比,4%添加组末重、 平均采食量与平均日增重无显著差异(P > 0.05)。 而8%组末重、平均采食量与平均日增重则显著降低(P < 0.05)。 数据还表明,日粮中添加4%和6%黄秋葵秸秆对料重比无显著影响(P > 0.05),当添加量达到8%,料重比显著增加(P < 0.05)。 日粮中添加秋葵秸秆可以改善、降低肉兔生长过程中的腹泻情况, 其中以4%添加量效果最好。
表3 饲粮中添加不同比例黄秋葵秸秆对肉兔生长性能的影响
2.2 饲粮中添加不同比例黄秋葵秸秆对肉兔血液生化指标的影响 由表4 可知,与对照组相比,4%组、6%组和8%组的总胆固醇分别降低了0.62、0.4、0.32 mmol/L, 其中4%组与对照组差异显著 (P < 0.05); 总胆红素分别降低了10.96、10.52、9.93 μmol/L; 天门冬氨酸氨基转移酶分别升高了12.67、21.00、32.17 U/L, 丙氨酸氨基转移酶也有一定提高,肌酐、尿素有一定降低,但均差异不显著(P > 0.05)。
表4 饲粮中添加不同比例黄秋葵秸秆对肉兔血液生化指标的影响
2.3 饲粮中添加不同比例黄秋葵秸秆对肉兔盲肠菌群结构的影响
2.3.1 盲肠菌群OTUs 数量分析 如图1 所示,4组有效序列的聚类,总共有OTUs 的数目为21231个, 对照组、4%组、6%组和8%组OTUs 数目分别为6749、6189、4960 和6846。4 组中共有OTUs 数目为262 个,对照组、4%组、6%组和8%组组独有的OTUs 数目分别为5196、4609、3711、5301 个。
图1 韦恩图
2.3.2 Alpha 多样性分析 由表5 可知, 各组的覆盖率均超过0.96,平均覆盖率为97%,说明测序样品满足后续盲肠菌群生物信息学分析的要求。Chao1 指数,6%添加组显著低于对照组、4%组和8%组 (P < 0.05),Shannon 指数和Simpson 指数,4 组之间差异均不显著(P > 0.05)。
表5 饲粮中添加不同比例黄秋葵秸秆对肉兔盲肠菌群Alpha 多样性指数影响
2.3.3 门水平 由表6 可知,4 组中的三大优势菌群占盲肠微生物丰度的比例为97.21%、96.21%、96.35%、97.32%, 且4 组间在厚壁菌门、拟杆菌门、疣微菌门的相对丰度上,均差异不显著(P > 0.05)。 厚壁菌门的相对丰度最高的为8%添加组达到91.65%,并且在3 个试验组中随着黄秋葵秸秆添加比例的增加, 相对丰度呈逐渐递增的趋势。 其余5 个菌门的丰度均在0.01%~ 1%,其中软壁菌门、糖化菌门、放线菌门的相对丰度4 组之间均差异不显著(P > 0.05),变形菌门的相对丰度8%组显著低于其他组(P < 0.05),蓝细菌门相对丰度对照组显著高于其他组(P < 0.05)。
表6 饲粮中添加不同比例黄秋葵秸秆对肉兔盲肠菌群门水平相对丰度的影响
2.3.4 属水平 由表7 可知,4%添加组罕见小球菌属的相对丰度显著高于对照组和6%添加组(P< 0.05),其他菌属的相对丰度各组之间均差异不显著(P > 0.05),但添加黄秋葵秸秆可以增加颤螺旋菌属的相对丰度。
表7 饲粮中添加不同比例黄秋葵秸秆对肉兔盲肠菌群属水平相对丰度的影响
3.1 饲粮中添加不同比例黄秋葵秸秆对肉兔生长性能的影响 目前关于黄秋葵秸秆对动物生产性能的影响还鲜见报道。 王明海等(2021)在肉兔日粮中添加1%、2%、3%和4%黄秋葵粉, 发现各组采食量无显著差异, 但3%添加组平均日增重显著增加,料重比显著降低,表明肉兔饲料中黄秋葵的适宜添加量为3%。 吴佳静等(2012)在蛋鸡饲料中添加不同比例的黄秋葵叶粉,结果表明,当在海兰褐蛋鸡饲料中添加3%~ 4%黄秋葵时,可提高海兰褐蛋鸡的产蛋率, 添加量为4%~ 5%则会导致蛋鸡采食量降低, 而5%~ 6%的添加量则会导致海兰褐蛋鸡的产蛋率下降。 本试验结果表明, 在肉兔日粮中添加4%的黄秋葵秸秆对其采食量、日增重及料重比均无显著影响,但当添加量达到6%和8%时,就会显著降低生产性能。 这可能是因为其中的粗纤维含量较高,影响了适口性,故而肉兔采食量会降低。同时还含有大量的多糖,多糖具有一定的黏性, 随着日粮中添加的黄秋葵秸秆含量增加,日粮的硬度和黏度也随之增加,故而日粮中黄秋葵秸秆比例越大, 日粮颗粒饲料的硬度越大, 肉兔采食越困难, 故而采食量也会降低。 本试验数据也表明了黄秋葵秸秆中的多糖和黄酮含量较高, 这也会导致粗纤维在消化道中能结合大量的水,使消化道的食糜体积增大,黏度增加,并形成凝胶,进而引起肠道微生物异常繁殖,造成动物生长受阻(辛松林等,2020),因而降低动物生产性能。
断奶幼兔因生长发育过快, 消化系统发育不完善,胃酸和消化酶分泌不足,从而导致腹泻甚至死亡(张海文等,2017)。日粮中添加一定量的黄秋葵秸秆可以有效改善肉兔的腹泻状况、 显著降低肉兔的死亡率;其中,以4%的添加量效果最好,这是因为黄秋葵秸秆中含有丰富的维生素(卢隆杰等,2004)和黄酮类物质,黄酮具有抗氧化(龙春等,2006)、防癌症的功效,可以显著降低肉兔生长疾病的发生、 减少肉兔肠道内大肠杆菌和沙门氏菌的感染,从而降低腹泻率和死亡率。
3.2 饲粮中添加不同比例黄秋葵秸秆对肉兔血液生化指标的影响 断奶肉兔生产性能和血液生化指标可以反映机体各项生理特征以及变化趋势,从而反映出断奶肉兔生长状况(Joshi,2002)。 AST和ALT 活性可反映肝脏对蛋白质和氨基酸的代谢能力(张邦等,2022)。 本试验中,试验组的AST 和ALT 均有所上升,可能是因为黄秋葵秸秆中含有大量黄酮、糖苷和多糖等生物活性成分,黄酮类具有抗氧化(刘辉等,2020;龙春等,2006)、提高肝脏代谢的能力,而多糖可以降低血脂(赵胜男等,2019),是保护肝脏的主要活性成分之一。 血清胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白水平是机体脂肪沉积的重要指标(郭志强等,2022;王敬军,2020),本试验中黄秋葵秸秆的添加,断奶肉兔血液中总胆固醇有着不同比例的降低,表明黄秋葵秸秆具有一定调节脂肪代谢的作用。 肌酐是机体组织中的代谢产物,血液中肌酐含量升高可能是因为机体内钾离子、钙离子等元素失衡所致;尿素是哺乳动物的代谢含氮终产物,当肝肾发生炎症或者重大疾病时,体内尿素含量会非正常性的升高;本试验中黄秋葵秸秆添加组与对照组相比肌酐和尿素均有所降低,这与张艳军等(2021)关于黄秋葵秸秆中的黄秋葵多糖可以降低血液中的血脂,改善肾脏组织的病理变化以及宋春蕾等(2017)表明黄秋葵秸秆具有一定的保肝护肾功能等相一致。
3.3 饲粮中添加不同比例黄秋葵秸秆对肉兔盲肠菌群结构的影响 Alpha 多样性又称为生物境内多样性,是指一个特定区域内的多样性,通常是用来反映微生物群落丰富度和多样性的综合性指标。Chao1 指数常用来反映菌群丰富度,Chao1 指数越大,说明物种丰富度越高。Shannon 指数和Simpson指数常用来反映菌群多样性(Holmstron 等,2004),Shannon 指数越大,说明群落多样性也越高。 由本试验结果可知,Chao1 指数,6%添加组显著低于对照组、4%组和8%组 (P < 0.05),Shannon 指数和Simpson 指数,4 组之间差异均不显著(P > 0.05)。说明了添加6%的黄秋葵秸秆量可以降低盲肠微生物菌群的丰度,这可能是因为黄秋葵秸秆中的某些成分选择性的促进益生菌的增殖,抑制其他致病菌的生长,从而使菌群的丰度和数量降低,这与张江亮等(2021)的研究结果基本一致。
本研究结果表明, 各组肉兔盲肠微生物菌群门水平的优势菌群是厚壁菌门、 拟杆菌门和疣微菌门,其中相对丰度最高的是厚壁菌门,其次是拟杆菌门、疣微菌门,这些结果与前人对肉兔盲肠菌群结构研究的结果相一致(冯国亮,2020; 武帅,2019)。 厚壁菌门的纤维分解菌较丰富,并且拟杆菌门相对丰度较高时, 纤维分解菌的含量也有所增加,因此当厚壁菌门和拟杆菌门的丰度升高,盲肠的发酵作用也随之增强(徐静,2020)。另外厚壁菌门的有益菌群包括双歧杆菌和乳酸杆菌等,有益菌占绝对优势时, 菌群间形成一种相对稳定的复杂的生态系统, 当菌群失衡时会引起腹泻和炎症(李岫怡,2019),拟杆菌门在维持肠道微生态平衡方面起着重要性作用, 可以改善宿主的健康状况。本试验结果表明,试验组中随着黄秋葵秸秆的添加量增加, 厚壁菌门的相对丰度不断增加,且8%的添加组高于对照组, 说明添加8%的黄秋葵秸秆可以提高厚壁菌门的丰度, 增加有益菌的含量,提高日粮纤维的发酵分解。变形菌门在肉兔盲肠菌群中所占比例较少,多为致病性病原菌,包括大肠杆菌、沙门氏菌、幽门螺旋杆菌等病原菌。 大肠杆菌和沙门氏菌在畜禽养殖中严重危害着动物机体的健康与引起肠道炎症有关, 如肠病和坏死性小肠结肠炎(张鑫,2018)。 本试验中添加8%的黄秋葵秸秆显著性降低了变形菌门的相对丰度,并且随着黄秋葵秸秆的添加量的增加, 变形菌门的相对丰度呈现出逐渐降低的趋势。 以上说明添加8%的黄秋葵秸秆可以提高肉兔盲肠微生物的部分优势菌群丰度,降低有害菌群的数量和丰度。
瘤胃球菌属主要作为营养和能源的提供者作用于肠道上皮细胞,对于纤维的分解能力较强(张凯歌,2021),颤螺旋菌属属于厌氧性菌属,来自梭状芽孢菌群Ⅳ,颤螺旋菌能将糖、淀粉等发酵转化为短链脂肪酸, 短链脂肪酸作为肠上皮细胞的首选能量,能抑制肠炎保护肠上皮细胞,对肠道健康具有重要作用(Kajander,2009)。
本试验结果显示, 添加黄秋葵秸秆可以增加颤螺旋菌属的丰度,其中以8%组最高。 罕见小球菌属是近年来在人类排泄物中新分离的严格厌氧的革兰氏阴性菌,呈多样性的球菌形态(Leclercq,2014)。 罕见小球菌属广泛存在于健康成人肠道内,并与肠道通透性息息相关(Vinolo,2011)。 有研究指出, 罕见小球菌属可通过发酵反应产生丁酸、 乳酸以及微量的乙酸和琥珀酸(Leclercq,2014),这些短链脂肪酸是肠上皮细胞的主要能量来源,参与维持肠道黏膜屏障、调节肠道炎症以及增加胃肠动力等 (Vitek,2015)。 本试验中添加4 %的黄秋葵秸秆显著性提高了罕见小球菌属的相对丰度, 且3 个试验组的罕见小球菌属相对丰度均大于对照组, 说明日粮中添加黄秋葵秸秆能够增加罕见小球菌属的相对丰度。 这提示黄秋葵秸秆可能通过提高颤螺旋菌属、 罕见小球菌属相对丰度,增加肠道短链脂肪酸含量,进而影响机体的能量代谢。
日粮中添加一定比例黄秋葵秸秆可以改善断奶肉兔的腹泻率,显著降低断奶肉兔的死亡率,并且对于断奶肉兔的肝肾功能有一定的调节作用;添加8%的黄秋葵秸秆可以提高厚壁菌门、 拟杆菌门、瘤胃球菌属、颤螺旋菌属的相对丰度,降低变形菌门的相对丰度。