BRCA1基因与肺腺癌免疫细胞浸润和预后的关系

骆许静 孙 桢 马耀先 方晓瑞

作者单位：461000 河南省许昌市中心医院

肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)是高发性的侵袭性非小细胞肺癌,发病率占全部肺癌的40%[1]。近年来,肺腺癌治疗主要以手术、放化疗、分子靶向治疗及免疫治疗等综合方案为主,极大程度的提高LUAD患者预后,但因患者个体差异与耐药性等因素影响,治疗效果仍被限制[2]。所以,迫切寻找肺腺癌的致病机制与高效、精准的诊治手段具有重要意义。临床大量证据发现肿瘤微环境(tumor immune microenvironment,TME)参与肿瘤疾病的发生及发展,TME为大量基质细胞维持,如肿瘤干细胞、癌内皮细胞、癌相关成纤维细胞及浸润免疫细胞[3-4]。癌细胞与其支持细胞间共同作用介导肿瘤发生增殖、抗凋亡、免疫逃逸等。大量研究报道,TME标志物可评估黑色素瘤、尿路上皮癌患者的预后,免疫相关标志物水平与免疫治疗密切相关[5-6]。进一步研究表明,免疫微环境中基因特征表达,可能是预测免疫抑制剂治疗效果的潜在生物标记物。

乳腺癌易感基因(breast cancer susceptibility gene 1,BRCA1)可介导DNA增强细胞修复DNA侵损能力,与癌症发展相关[7]。临床已发现BRCA1基因是预测乳腺癌疗效、预后的重要因子[8]。目前BRCA1在LUAD中作用研究较少,关于其免疫治疗效果及预后预测价值不明。本研究通过公共数据库,分析BRCA1基因表达与LUAD免疫细胞浸润和预后的关系,研究其在肺腺癌免疫微环境中可能的作用,深入探讨BRCA1基因在肺腺癌发生、发展及治疗中的作用机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源

收集2019年1月至2022年1月间68例手术切除新鲜肺腺癌组织与癌旁肺组织(>癌组织边缘10 cm)标本,患者均为首次就诊,术前未采取任何抗肿瘤治疗,术后病理证实为肺腺癌。其中男性41例,女性27例,年龄29～78岁,平均年龄(67.49±9.23)岁;TNM分期:Ⅰ～Ⅱ期58例,Ⅲ～Ⅳ期10例;淋巴结转移27例。本次研究提交我院伦理委员会并审核通过,并取得患者或家属签字知情同意书。

1.2 qRT-PCR检测BRCA1mRNA水平

新鲜标本存放于RNA稳定性RNA later保存液(上海钰博生物科技有限公司)中2 ℃保存待用,RNA提取:采用Trizol试剂(赛默飞世尔科技中国有限公司)盒提取组织中总RNA并提纯,参照荧光定量PCR试剂盒(赛默飞世尔科技中国有限公司)说明配置20 μlPCR反应体系,BRCA1引物序列:上游5' AUGGCCUC--CGUCU-C-CCAGCUUGC 3,下游3' UUCCA-AGUUGUAAAAUGUGGUCGA-CG 5';反应条件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,40个循环,采用2-△△Ct方法与GAPDH水平为基线对结果矫正处理BRCA1mRNA相对表达量。

1.3 免疫组化

取癌组织和癌旁组织标本后给予生理盐水冲洗,冲洗后将标本样品保存于冻存管中,采用油性笔记号并编号,保存于-196 ℃液氮罐中。为确保组织中RNA酶有效性不被破坏,在样本离体后10 min内完成检验,采用4%多聚甲醛溶液(赛默飞世尔科技中国有限公司)固定样本,采用石蜡包埋后切厚度为4 μm的切片,应用全自动免疫组化染色仪(型号:AttoStar®-4800A,艾托金生物医药(苏州)有限公司),染色程度参照BRCA1试剂盒(上海酶联生物科技)说明书进行。结果判定:BRCA1阳性着色为细胞核呈棕黄色。

1.4 公共数据库分析

1.4.1 Oncomine数据库分析BRCA1基因在肺腺癌组织中的表达 采用Oncomine数据库(https://www.oncomine.org/resource/login.html)分析BRCA1基因在泛癌中的表达水平。设置条件为:“Gene:BRCA1”“Analysis Type:Cancer vs.Normal”“THRESHOLD BY:P-VALUE<0.01,FOLD CHAGE>2,GENE RNAK=Top 10%,Date type:All”。

1.4.2 Kaplan-meier Plotter数据库分析 Kaplan-meier Plotter数据库在GEO、EGA与TCGA等公共数据库基因芯片及RNA-seq数据基础上建立,可对特定基因临床预后价值进行评估,根据患者样本参照基因中位表达(高表达与低表达)分为两组,采用Kaplan-Meier生存曲线分析肺腺癌患者的总体生存率。

1.4.3 TIMER数据库分析 TIMER数据库(http://timer.cistrome.org/)作为系统分析不同癌症类型的免疫浸润综合数据库,可通过TCGA(The cancer genome atlas)数据库肿瘤中采用Diff Exp模块辨别肿瘤与邻近正常组织之间靶基因的差异表达,本研究中,采用TIMER数据库分析BRCA1在肺腺癌中的表达。通过反卷积方法从基因表达谱中分析肺腺癌浸润免疫的丰富度,采用Immune Association模块中Gene分析BRCA1基因表达与免疫细胞浸润丰度的关系。

1.5 统计学分析

应用R软件包(4.1.3版本)完成统计学分析,癌组织及癌旁组织中BRCA1 mRNA表达水平呈正态分布,组间采用t检验;Kaplan-Meier生存曲线评估BRCA1基因对肺腺癌预后的影响;Spermans相关性检验 BRCA1基因与免疫细胞浸润的相关性,以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 肺腺癌BRCA1基因差异表达

采用Oncomine数据库比较不同恶性肿瘤及配对癌旁组织中BRCA1基因水平,见图1;分析显示肺腺癌(LUAD)中BRCA1基因水平高于癌旁组织(P<0.05),见图2;qRT-PCR检测结果显示肺腺癌组织中BRCA1 mRNA表达水平高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05),见图3,与Oncomine数据库结果一致。

图1 Oncomine数据库分析各种类型恶性肿瘤组织与癌旁组织中BRCA1基因表达

LUAD为肺腺癌组织;Normal为癌旁组织。

图3 qRT-PCR检测BRCA1 mRNA表达水平

2.2 肺腺癌BRCA1免疫组化

免疫组化学染色法检测BRCA1表达,癌旁组织见清晰的细胞结构,大小均匀,排列规则,见低度BRCA1浅棕黄色表达、癌组织腺癌细胞大小不一,呈混乱排列,且结构异常,BRCA1在细胞核中呈棕黄色。

2.3 BRCA1基因表达与肺腺癌免疫细胞浸润的相关性

TIMER数据库分析,BRCA1表达与中心粒细胞(γ=0.147,P=1.28×10-3)浸润水平具有强相关性,但与B细胞(γ=-0.09,P=4.73×10-2)、CD8+T细胞(γ=0.047,P=3.00×10-1)、CD4+T细胞(γ=0.039,P=3.91×10-1)、巨噬细胞(γ=-0.038,P=4.05×10-1)及树突状细胞(γ=0.039,P=3.85×10-1)无相关性,见图4。

图4 BRCA1基因表达与肺腺癌免疫细胞浸润的相关性

2.4 BRCA1基因表达与肺腺癌预后的关系

Kaplan-meier Plotter数据库分析,BRCA1基因高表达肺腺癌患者总生存期短于低表达者,无病生存率低于低表达肺腺癌患者,差异有统计学意义(P<0.05),见图5。

图5 BRCA1基因表达与肺腺癌预后的关系

3 讨论

近年来BRCA1在临床肿瘤中的表达及功能逐渐报道,其中在乳腺癌研究较多。多项研究表明,BRCA1是乳腺癌的潜在生物标志物及免疫治疗靶点;BRCA1在乳腺癌组织中呈下调表达,BRCA1基因表达与临床病理、复发机预后密切相关[9-10]。同时,BRCA1可对乳腺癌细胞周期调控、基因转录及DNA的损伤修复[11]。但有关BRCA1基因表达与LUAD患者的潜在作用及预后关系鲜少有报道。基于此本文通过分析BRCA1基因对LUAD预后及免疫微环境的关系,进一步为LUAD预后评估及免疫治疗提供新策略。

我们对公共信息库数据分析发现,BRCA1基因在LUAD组织中表达均高于正常组织;本研究qRT-PCR检测结果分析肺腺癌组织中BRCA1 mRNA表达水平高于癌旁组织;生存分析结果显示,BRCA1基因高表达肺腺癌患者总生存期、无病生存率短于低表达肺腺癌患者,差异有统计学意义(P<0.05)。以上结果表明,BRCA1可影响LUAD发展,且可能为LUAD预后的生物标志物。

免疫浸润与肿瘤微环境对不同肿瘤发生发展发挥关键作用,肿瘤分子特征与免疫微环境间发挥协同作用而影响不同临床结果[12-13]。本研究发现,TIMER数据库分析,BRCA1表达与中心粒细胞(γ=0.147,P=1.28×10-3)浸润水平具有强相关性,但与B细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、巨噬细胞、及树突状细胞无相关性。中性粒细胞是机体外周血中丰富的白细胞,可介导吞噬作用、脱颗粒、大量分泌活性氧等预防病原体侵袭;同时中性粒细胞可形成特殊的细胞死亡程序中性粒细胞外诱补网(neutrophil extracellular traps,NETs),介导机体不同病理生理发展[14-15]。临床报道,NETs在肺癌、胃癌等患者中呈上调表达,随肿瘤微环境改变NETs可直接作用[16-17]。临床还发现,NETs大量存在于乳腺癌、结直肠癌患者发生肝转移病灶中,提升肿瘤细胞活性,使肿瘤短期中出现转移[18]。在肿瘤微环境中,相关免疫抑性细胞如巨噬细胞、调节性T细胞等可辅助肿瘤发生免疫逃逸,如恶性肿瘤细胞产生的趋化因子可加快中性粒细胞形成NRTs,阻断免疫细胞与邻近靶向细胞的结合,促进肿瘤细胞受CD8+T细胞及自然杀死细胞调控的细胞毒性作用[19-20]。所以NETs可能作用肿瘤微环境辅助肿瘤细胞免疫逃逸,加快肿瘤发生进展。所以,本次研究结合数据库分析结果与既往研究表明,BRCA1基因可能调控中性粒细胞与肿瘤细胞间的协同作用加快LUAD进展。

综上所述,本研究结果初步表明BRCA1基因在肺腺癌组织中呈上调水平,下调BRCA1表达水平有望改善肺腺癌患者预后,BRCA1表达水平与肺腺癌中性粒细胞浸润密切相关,表明其在肺腺癌发展过程中发挥关键生物学作用,且为肺腺癌治疗提供新的免疫靶点。但本研究结果是基于生物学信息库分析上,BRCA1与肿瘤微环境中的免疫浸润及调节仍待进一步验证,有待更详细且具体的体内外研究。