徐黄合剂的制备工艺优化及含量测定

程涛， 马诗瑜，宋平，卞晓岚,*， 郑岚，叶腾飞

(1.上海交通大学医学院附属瑞金医院卢湾分院药剂科，上海 200020；2.上海交通大学医学院附属瑞金医院药剂科，上海 200025)

0 引言

徐黄合剂，本方来源于上海交通大学医学院附属瑞金医院中医科、名老中医夏翔教授的多年临床经验，由黄芪、徐长卿、蒲黄、淫羊藿四味药组成，具有益气活血利脉，温阳消斑除瘀的功效。现代药理学研究表明[1]，该方活血化瘀、保护心肌、调节血脂、调节血糖的功效，对气虚血瘀证型冠心病、糖尿病性下肢动脉硬化闭塞症及大血管病变有良好的治疗作用，已在医院广泛应用多年。徐黄合剂重用黄芪为君药，使脾胃之元气得以大补，从而令气旺而血行，瘀去则络通[2]。故在现代中药制剂研究中，以君药黄芪中的主要成分黄芪甲苷为制剂工艺和含量测定的主要考察指标，采用正交试验方法确定最佳提取工艺并初步建立含量测定方法。本试验为最大程度地保留原制剂的特色，拟将其制成合剂，通过提取、浓缩等工艺，提高制剂有效成分含量，减少药物服用量，从而方便服用及携带，为后续大量生产质量稳定、可控的徐黄合剂提供实验依据。

1 试验药品及主要仪器

1.1 仪器

高效液相色谱仪(HPLC，岛津公司，LC-2020PLUS)，高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD，大连依利特分析仪器有限公司，ELSD-UM5000)，电子分析天平(梅特勒托利多公司FA104)。

1.2 试药

黄芪、徐长卿药材购于上海同济堂药业，蒲黄、淫羊藿苷药材购于安徽盛海堂中药饮片有限公司，所有药材在使用前经鉴定，均符合《中药药典》2020 版各药材项下相关规定。黄芪甲苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号120924)；含量测定用甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 徐黄合剂制备工艺优化

2.1.1 正交实验设计

按处方比例称取黄芪、徐长卿、蒲黄、淫羊藿药材，以A 加水量(倍)、B 煎煮时间(h)、C 煎煮次数(次)为主要考察因素每个因素设置三个水平，选用L9(34)正交试验设计表安排试验，提出的药液进行过滤、合并、浓缩至相同体积。采用高效液相色谱法测定制剂中黄芪甲苷含量，并以之为主要参考指标，优化提取工艺，各因素水平设计如表1 所示，试验及方差分析结果如表2 和表3 所示。

表1 正交试验因素水平

表2 正交试验优选结果

表3 方差分析结果

由正交试验结果方差分析可知，在设计水平范围内，各样品比较均无显著性差异。采用直观分析，以黄芪甲苷为指标所得最优结果为 A2B2C3。对于黄芪甲苷来说，该成分一般在实验室中可以采用索氏提取的方法，通过多次回流提取来提高提取效率。但在实际大批量生产过程中，从省时节能、降低成本方面综合考虑，最终确定徐黄合剂提取工艺条件A2B1C2，即加入 药材6 倍量的水，每次提取1 h，共提取2 次。

2.1.2 验证试验

按照处方比例称取制剂所需的药材，加入6 倍量的水，浸泡30 min，煎煮2 次，每次提取沸后保持1 h，趁热过滤，合并药液，浓缩至250 mL。测得3 批样品黄芪甲苷含量分别为0.214、0.218 和0.216 mg/mL，RSD为0.93%，结果表明在该制备工艺条件下，制剂中黄芪甲苷含量较稳定，工艺合理、可行。

2.1.3 浓缩工艺研究

按处方量称取全方药材，根据最优提取工艺，合并所有提取的药液，平行制备12 份供试品，供试品1～6 采用常压浓缩，供试品7～12 采用减压浓缩(-0.085 MPa，60～80 ℃)。采用 t 检验方法(Origin 7.5统计软件)对两种工艺条件下测定的黄芪甲苷转移率比较，结果两种浓缩工艺对黄芪甲苷含量无显著影响(P＞0.05)，且黄芪甲苷转移率均较高，结果如表4 所示。

表4 不同浓缩方法的考察结果

表5 精密度试验考察结果

2.2 样品含量测定方法学

2.2.1 色谱条件

色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(OS034223，4.6×250 mm, 5 μm)；流动相组成为乙腈-水(34∶66)；流速为1.0 mL/min；ELSD 参数：蒸发区温度为90 ℃；雾化区温度40 ℃；气流速度为1.50 mL/min；进样体积为20 μL。理论塔板数按黄芪甲苷计算，不低于4 000。

2.2.2 样品溶液的制备

对照品溶液制备：精密称定黄芪甲苷对照品9.96 mg，加甲醇溶解，最后定容至10 mL 摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

供试品溶液制备：精密移取徐黄合剂20 mL，加入水饱和正丁醇20 mL，摇匀萃取，按照上述方法萃取3 次，分取、合并正丁醇层，加入氨试液30 mL 洗涤，重复洗涤3 次。滤液水浴蒸干，残渣加甲醇溶解，定容至5 mL。0.45 μm 微孔滤膜过滤，即得。

阴性样品溶液制备：按处方比例去除黄芪药材，同上述供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。

2.2.3 专属性试验

分别吸取“2.2.1”项下3 种样品溶液，注入HPLC，阴性样品在对照品相应位置无其他封出现，结果表明：该制备方法及色谱条件下阴性样品无干扰。结果如图1～图3 所示。

图1 对照品溶液色谱图

图2 供试品溶液色谱图

图3 阴性样品溶液色谱图

2.2.4 标准曲线的准备

以“2.2 项下”对照品溶液为母液，制备浓度分别为 0.048 16 mg/mL、0.096 32 mg/mL、0.192 6 mg/mL、0.481 6 mg/mL、0.963 2 mg/mL 的标准品溶液。以黄芪甲苷量的自然对数(lnm)为横坐标(X)，色谱峰面积的自然对数(lnA)为纵坐标(Y)，并进行回归计算，求得黄芪甲苷回归方程为y=1.614 9x+1.341 9，r²=0.999 4，线性范围为0.048 16～0.963 2 mg/mL。

2.2.5 精密度试验

精密吸取同一对照品溶液，连续进样6 次，记录峰面积，计算黄芪甲苷RSD，结果表明仪器精密度良好。

2.2.6 重复性试验

精密移取徐黄合剂，按照“2.2.1”项下供试品制备方法制备6 份样品，过0.45 μm 微孔滤膜后，注入HPLC，测定黄芪甲苷含量，测定表明该样品处理方法和含量测定方法重复性良好，制剂中黄芪甲苷平均含量为0.213 8 mg/mL。数据如表6 所示。

表6 重复性试验考察结果

2.2.7 稳定性试验

取制备的徐黄合剂适量，按照“2.2.1”项下供试品制备方法制备样品溶液，过0.45 μm 微孔滤膜后，将供试品溶液保存于室温下，每隔2 h 或更长的时间测一次黄芪甲苷的峰面积，并计算RSD 值，结果样品在12 h 内稳定性良好，如表7 所示。

表7 稳定性考察结果

2.2.8 准确性试验

取已知浓度的徐黄合剂9 份，分别精密加入低、中、高三个剂量对照品溶液，制成供试品溶液，HPLC法测定峰面积，计算样品回收率。经计算平均回收率为101.84%，RSD 为2.45%，结果表明该分析方法准确性符合规定，如表8 所示。

表8 准确性试验考察结果

3 讨论

徐黄方剂在长期的临床实践中取得显著的治疗效果，扩大其临床应用是必然趋势。传统汤剂在使用中，存在服用不便、质量难控、量大难喝、携带不便等缺点[3]。综合考虑临床应用及产品特点，本实验在徐黄方汤剂基础上开发徐黄合剂。合剂能保留方药中多种有效成分，以发挥中药多组分、多靶点的治疗特点，并且合剂口服吸收快，生物利用度高，可达到快速缓解患者病情的目的[4-5]。

黄芪甲苷是徐黄合剂中君药黄芪的主要有效成分，具有良好的心脏保护作用，在动物实验研究中，其表现出明显的改善心脏功能与血流动力学作用[6]，加强心肌收缩力的同时[7]，不增加心肌耗氧量，减少心肌梗死面积，降低心律失常发生率等，因此黄芪甲苷可作为药效指标性成分之一。本试验采用的黄芪甲苷含量测定方法主要参考了《中国药典》 2020 版一部黄芪项下含量测定相关内容，试验结果表明黄芪甲苷在0.048 16～0.963 2 mg/mL 范围内呈现出良好的线性关系，阴性样品无干扰，仪器精密度、方法重复性、准确性均在相关要求范围内，说明黄芪甲苷含量测定方法成熟[8-9]、稳定、重复性好，能够满足工艺考察要求，故本研究选取黄芪甲苷为含量测定评价指标，研究结果可作为制剂质量标准研究的一部分。

徐黄组方中，与其功能主治相关的化学成分具有较好的水溶性，宜采用水提法，以保留原方特色和药效物质基础。同时水提法具有操作相对简单，生产成本较低，药物制剂具有巨大的经济优势。但中药复方制剂成分复杂，提取工艺的优劣直接影响有效成分的控制及临床疗效[10]。本实验选取加水量、提取次数、煎煮时间三个因素，采用正交试验法对水提工艺条件进行考察，试验结果通过方差分析和直观分析，确保提取工艺的可靠和合理。本试验结果表明，3 个因素对制剂的提取无显著影响，最终从生产效率、资源节约及实际生产操作等因素综合考虑，确定徐黄合剂最佳提取工艺为加入药材量6 倍水，浸泡30 min，煎煮沸后1 h，提取2 次。验证试验结果表明，该提取工艺稳定，为今后徐黄合剂大批量生产建立了初步工艺流程。

综上，本研究以临床上疗效确切的验方徐黄方为研究对象，将其设计制备成合剂，既符合传统用药特点，又满足开发有效成分明确的现代中药理念，符合中药现代化发展方向。研究影响徐黄合剂提取工艺的主要因素，优化制剂制备工艺，利用现代分析技术明确制剂有效成分含量，为生产大批量稳定性高、有效成分可靠、质量可控的徐黄合剂提供实验基础。