李艳丽,文怡静,陈文锋,何良,凌博,叶广彬
(1. 右江民族医学院基础医学院,广西 百色 533000;2. 右江民族医学院护理学院,广西 百色 533000;3. 右江民族医学院医学影像学院,广西 百色 533000)
鼻咽癌是耳鼻咽喉头颈外科中常见的恶性肿瘤之一,通常起源于鼻咽黏膜上皮,具有易转移、高发病率和致死率等临床特点[1-2]。针对鼻咽癌的临床治疗方案通常以放化疗、分子靶向药物治疗和免疫治疗为主,但疗效仍存在不足之处,如5年生存率低、易产生耐药性和不良反应等[3]。中药在防治鼻咽癌中具有疗效确切、低毒副作用和改善放化疗不良反应等作用[4]。因此,中西医结合的疗法可能成为有效解决上述难题的策略之一。
川芎是现代中西医结合抗癌中的常用药物之一,以川芎作为核心组分的中成药(如川芎茶调散、鼻窦炎合剂),在鼻咽癌的防治中起到了降低化疗副作用、降低淋巴结肿大和增效等作用[5-7]。然而川芎抗鼻咽癌的物质基础和药效机制不明,制约其临床开发和应用。川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)是中药川芎的有效成分,已被证明对多种恶性上皮肿瘤具有抑制作用[8-9]。因此,川芎嗪是否具有抗恶性上皮起源的鼻咽癌的作用值得进一步研究。本研究通过体外细胞实验探究川芎嗪对鼻咽癌CNE-2细胞恶性生物学行为的作用及其机制,为开发抗肿瘤药物提供实验基础。
1.1材料 川芎嗪和二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma公司;鼻咽癌CNE-2细胞购自中国科学院上海细胞库;CCK-8购自Biosharp公司;PI3K和磷酸化PI3K(p-PI3K),Akt和磷酸化Akt(p-Akt)等抗体购自Abcam公司;BCA检测试剂盒、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)和辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG(H+L)、ECL化学发光试剂均采购于上海碧云天生物技术有限公司;10%PAGE凝胶快速制备试剂盒和三色预染蛋白Marker购自上海雅酶生物医药科技有限公司。
1.2细胞培养和药物制备 鼻咽癌CNE-2细胞培养使用RPMI 1640培养基,含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素,置于37 ℃,5% CO2培养箱中培养。用DMSO溶解TMP粉末,配制成1 mg/mL的储存液,避光储存于-20 ℃冰箱中,用RPMI 1640完全培养基稀释成不同浓度的TMP工作液(0 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL和400 μg/mL)。
1.3CCK-8检测 取对数生长期的CNE-2细胞制成细胞悬液,计数并接种于96孔板,每孔接种100 μL(5×103个细胞),设置6个复孔。待细胞长满后,更换含0 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL和400 μg/mL TMP的完全培养基,对照孔中添加完全培养基和DMSO溶液,分别在培养24 h、48 h和72 h时采用CCK-8法检测细胞增殖能力,具体操作方法参考试剂盒说明书。最后使用多功能酶标仪在450 nm波长下检测各孔在波长450 nm处的吸光值,并按照公式计算细胞增殖抑制率并绘制曲线。
1.4流式细胞术 取对数生长期的CNE-2细胞以1×104个/孔接种于96孔细胞培养板中,培养过夜,加入终浓度为400 μg/mL TMP,对照组中加入DMSO溶液,培养24 h后,加入胰蛋白酶消化,用PBS调整细胞密度为1×107cells/mL。取1 mL的细胞悬液,1 000 r/min离心10 min,弃上清,用预冷的PBS重悬细胞,1 000 r/min、4 ℃离心10 min,吸除上清液,加结合缓冲液2 mL混合后,再加入5 μL碘化丙啶PI溶液和10 μL膜联蛋白V-FITC溶液,放在避光环境中孵育15 min,加入300 μL的缓冲液,流式细胞仪上机检测CNE-2细胞凋亡的情况。
1.5划痕实验 取对数生长期的CNE-2细胞计数并调整细胞密度为5×105cells/mL,接种于6孔细胞培养板中,每孔1 mL,待细胞长满后,用20 μL枪头在孔内竖线划痕,并加入终浓度为400 μg/mL TMP的无血清培养基培养CNE-2细胞。然后分别在0 h和24 h用显微镜进行观察孔内细胞的愈合情况,拍照记录。
1.6Western Blot实验 使用终浓度为400 μg/mL TMP干预CNE-2细胞后,取细胞总蛋白进行SDS-PAGE电泳,转膜。PVDF膜用5%脱脂奶粉封闭2 h,TBST洗涤3遍,添加一抗(一抗稀释液1∶2 000稀释)后,4 ℃静置过夜。TBST洗涤3遍,二抗(5%脱脂奶粉1∶1 000稀释)室温孵育2 h。取出PVDF膜,TBST洗涤3遍,滴加ECL显影液,在凝胶成像系统下显影成像。
2.1川芎嗪抑制鼻咽癌CNE-2细胞增殖 研究川芎嗪对鼻咽癌CNE-2细胞增殖能力的影响。采用浓度0 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL和400 μg/mL的川芎嗪分别作用CNE-2细胞24 h、48 h和72 h,从而确定时效和量效。结果表明(见图1),与对照组(0 μg/mL)相比,不同浓度的川芎嗪对CNE-2细胞增殖均有抑制作用,且呈现出浓度和时间依赖性(P<0.05)。
图1 不同浓度的川芎嗪对鼻咽癌CNE-2细胞增殖的影响
2.2川芎嗪促进鼻咽癌CNE-2细胞凋亡 流式细胞术检测川芎嗪对鼻咽癌CNE-2细胞凋亡的影响。结果表明(见图2),采用400 μg/mL川芎嗪处理鼻咽癌CNE-2细胞24 h后,实验组细胞凋亡率明显高于对照组(P<0.01),这提示川芎嗪可以诱导促进CNE-2细胞凋亡。
注:**P<0.01。图2 川芎嗪对鼻咽癌CNE-2细胞凋亡的影响
2.3川芎嗪抑制鼻咽癌CNE-2细胞迁移 细胞划痕实验结果显示(见图3),采用400 μg/mL川芎嗪处理CNE-2细胞24 h后,实验组中CNE-2细胞的迁移距离明显短于对照组(P<0.01),结果提示川芎嗪可以抑制鼻咽癌CNE-2细胞的迁移。
注:**P<0.05。图3 川芎嗪对鼻咽癌CNE-2细胞迁移的影响
2.4川芎嗪对CNE-2细胞迁移相关蛋白的表达影响 采用400 μg/mL川芎嗪处理鼻咽癌CNE-2细胞24 h后,与对照组(0 μg/mL)相比,如图4所示,细胞迁移相关蛋白N-cadherin、Snail和Vimentin表达均明显降低,而E-cadherin则表达明显升高(P<0.01)。这一结果提示川芎嗪可以抑制CNE-2细胞的上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),从而达到抑制CNE-2细胞迁移的作用。
注:**P<0.01。图4 川芎嗪对CNE-2细胞侵袭迁移相关蛋白的表达影响
2.5川芎嗪对PI3K/Akt信号通路蛋白的表达影响 采用400 μg/mL川芎嗪处理鼻咽癌CNE-2细胞24 h后,与对照组(0 μg/mL)相比,如图5所示,川芎嗪能够提高促凋亡蛋白Bax表达,而降低抗凋亡蛋白Bcl-2表达(P<0.01)。此外,川芎嗪能够有效降低p-PI3K和p-Akt的表达水平(P<0.01),抑制PI3K/Akt的磷酸化水平,从而抑制PI3K/Akt信号通路的激活。这些结果提示川芎嗪可以通过抑制PI3K/Akt信号通路的激活,继而促进CNE-2细胞凋亡。
注:**P<0.01。图5 川芎嗪对CNE-2细胞的PI3K/Akt信号通路蛋白的表达影响
在鼻咽癌的临床治疗里,中西医结合的方法是治疗主流趋势之一,在发挥西医(放化疗、手术和分子靶向药物等)将肿瘤杀灭的同时,兼具中药降低毒副作用和不良反应的功能,从而整体提升患者的临床治疗效果[10]。因而,筛选抗鼻咽癌的中药成为重要的研究工作之一。
川芎是我国重要的中药之一,通常具备活血行气和祛风止痛的作用。然而川芎的现代应用中,抗肿瘤活性是其开发的重要方向,其中川芎抗肿瘤的核心活性成分为川芎嗪[11]。川芎嗪抗肿瘤为其进一步的中西医联合防治肿瘤起到了关键推进作用,如紫杉醇联合川芎嗪在肝癌治疗中的开发潜力[12]。与此同时,川芎在鼻咽癌的防治中也得到了一定程度的应用,其中以川芎茶调散最具代表性[13]。为了进一步挖掘川芎抗鼻咽癌的具体有效成分和药理作用,本研究以鼻咽癌CNE-2细胞为研究对象,以不同浓度的川芎嗪干预CNE-2细胞发现,川芎嗪可以促进CNE-2细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖和迁移。由此可以得出,川芎嗪是川芎的潜在性抗鼻咽癌活性成分之一。
PI3K/Akt信号通路是细胞内维持增殖活性和降低凋亡水平的经典信号通路[14]。在肿瘤细胞中PI3K/Akt信号轴在发生蛋白磷酸化活化后形成p-PI3K和p-Akt调控下游Bax和Bcl-2等增殖凋亡相关蛋白的表达平衡,从而维持肿瘤细胞的高增殖和低凋亡效率[15]。郭利培等[16]研究发现吴茱萸碱可以通过抑制PI3K/Akt信号通路活性,下调增殖及凋亡相关蛋白的表达水平,从而抑制鼻咽癌5-8F细胞增殖和诱导细胞凋亡。尹倩等[17]研究发现辣椒素可以通过调节PI3K/Akt信号通路抑制鼻咽癌细胞增殖和侵袭能力,以及诱导细胞凋亡,从而提高患者生存时间。此外,李本珊[18]研究发现羟喜树碱可以通过TGF-β诱导的PI3K/Akt信号通路抑制鼻咽癌HK1和C666-1细胞增殖,导致细胞周期的阻滞,以及抑制鼻咽癌细胞的侵袭和转移。因而,PI3K/Akt信号通路普遍认为是评价药物作用肿瘤细胞增殖和凋亡的有效靶点之一。本研究中对不同浓度的川芎嗪作用鼻咽癌细胞进行蛋白检测发现,CNE-2细胞经川芎嗪药物处理后,PI3K/Akt信号通路明显被抑制,而细胞凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax比值下降。这预示着川芎嗪可以通过抑制PI3K/Akt信号通路的激活,从而促进鼻咽癌CNE-2细胞凋亡。
在肿瘤细胞的转移过程中EMT化是起始步骤,也是抗转移类药物开发的重要方向[19]。肿瘤细胞EMT化过程中钙黏连蛋白发挥着重要的作用,其中上皮样标志物E-cadherin动态下降、间充质标志物N-cadherin和Vimentin表达水平提升,降低肿瘤细胞间的黏附能力,为其EMT化提供重要的动力[20-21]。肿瘤细胞EMT化中Vimentin蛋白负责细胞骨架的功能,从而确保EMT化中伪足的形成[22]。刘晓燕等[23]研究利用蒲公英多糖(200 μg/mL、400 μg/mL)处理三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞后,Western Blot检测发现MDA-MB-231细胞中E-cadherin表达水平上调,而N-cadherin和Vimentin表达水平下调,结果表明蒲公英多糖能够有效抑制MDA-MB-231细胞迁移、侵袭和EMT化,其机制可能与抑制PI3K/Akt/GSK-3β信号通路激活有关。朱军辉等[24]利用RNA干扰技术敲低钙网蛋白表达后,发现鼻咽癌CNE-2细胞中E-cadherin表达显著增高,Vimentin、TGF-β以及MMP-9蛋白表达降低,结果表明钙网蛋白可以诱导CNE-2细胞发生EMT,从而促进鼻咽癌的迁移和侵袭。由此可见E-cadherin、N-cadherin和Vimentin是肿瘤细胞发生EMT化和转移的核心靶标。本研究中发现川芎嗪可显著抑制CNE-2细胞中N-cadherin和Vimentin蛋白的表达,提升E-cadherin蛋白的表达,推测川芎嗪可以抑制CNE-2细胞的转移能力,与其对E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的调控作用关系密切。
综上所述,川芎嗪是川芎的可能性抗鼻咽癌活性成分之一,其中川芎嗪可以促进鼻咽癌CNE-2细胞凋亡、抑制CNE-2细胞增殖和迁移,核心机制与其对PI3K/Akt通路,以及E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表达的调控关系密切。