胃癌诊断生物学标志物的研究进展

孟文婷 王蔚虹

北京大学第一医院消化内科（100034）

胃癌是目前世界上发病率较高的肿瘤之一，2020 年全球胃癌新确诊病例数>100 万例[1]，其中中国胃癌发病例数约占世界病例数的50%[2]，而胃癌预后与治疗时机息息相关，早期诊断和治疗对提高胃癌患者的生存率至关重要。早期胃癌患者通常无特异性症状，胃癌诊断主要依赖胃镜和组织病理学检查，但操作过程复杂且费用较高，限制了其在大规模无症状人群中的筛查和普及[3]。因此，探索可应用于胃癌筛查的无创或微创诊断方法对早期发现胃癌尤为重要。

生物学标志物（如DNA、RNA、蛋白质）能反映人体内生理、生物化学、免疫等多方面改变，其中部分来源于恶性肿瘤细胞或由肿瘤组织刺激人体所产生，对肿瘤具有提示意义[4]。血液、胃液、唾液、尿液等均可作为胃癌生物学标志物的来源，本文对部分胃癌诊断生物学标志物的研究进展作一综述。

一、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen,CEA）

CEA 是存在于消化道肿瘤细胞与胚胎结肠上皮细胞的一种糖蛋白，一般只在胎儿期存在，若人体细胞发生癌变，则可以重新分泌。健康成人血液CEA 浓度＜2.5 μg/L，CEA 异常升高时提示有消化系统肿瘤（包括结肠癌、胃癌、胰腺癌等）的风险。作为广谱生物学标志物，CEA 升高也可见于肺癌、乳腺癌等。研究发现CEA 过度表达发生于包括胃癌在内的60%的肿瘤[5]，且在肿瘤早期诊断的敏感性和特异性均不高，对于胃癌筛查价值有限。

二、糖类抗原（carbohydrate antigen,CA）72-4

CA72-4 是一种高分子质量的黏液糖蛋白，对胃癌也具有提示意义。研究发现，单独应用CA72-4 诊断胃癌的敏感性为49%，特异性为96%[6]。对该肿瘤标志物的连续监测、联合检测有助于提高诊断的敏感性，可应用于胃癌筛查。但该生物学标志物在卵巢癌、结直肠癌、乳腺癌中也有一定的阳性率。

三、DNA

DNA 是生物遗传信息的载体，肿瘤DNA 携带肿瘤细胞的遗传学特征，DNA 丰度和相关特征（基因突变、甲基化）等可作为肿瘤筛查的重要指标。

1. 循环游离DNA（circulating cell-free DNA, cfDNA）：cfDNA 是细胞释放到血浆中的降解DNA 片段，可来源于正常组织或肿瘤，其中由肿瘤细胞释放的cfDNA又称为循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）。cfDNA 丰度、甲基化水平均对肿瘤有提示意义，有望作为胃癌诊断的生物学标志物。

①cfDNA 丰度：肿瘤组织增殖迅速，故肿瘤患者外周血中cfDNA 丰度远高于健康人群。Kim 等[7]以实时定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）方法检测30 例胃癌患者和34 名健康对照者血浆cfDNA 水平，发现健康对照者、早期和进展期胃癌患者血浆中可检测到的cfDNA 丰度平均值分别为（79.78±8.12）、（106.88±12.40）和（120.23±10.08）μg/L。若取90 μg/L 为临界值，cfDNA 作为胃癌筛查生物学标志物的ROC曲线下面积（AUC）为0.991，敏感性、特异性分别为96.67%、94.11%。

实时定量PCR 是目前常用的DNA 定量检测方法，但DNA 提取、纯化和多次核酸扩增均可能影响结果的准确性。基于支链DNA-Alu检测技术是定量测定cfDNA的新方法，分支DNA 依据固相杂交可结合多个酶标志物，以便于检测靶标。Alu 重复序列是基因组中重复次数最多的序列，检测到的Alu 数量与cfDNA 丰度密切相关。该法无需核酸扩增，敏感性和准确性较高。Qian 等[8]以支链DNA-Alu 检测技术定量检测124 例胃癌患者、64 例胃良性疾病患者、92 名健康者的cfDNA水平，结果显示健康者、胃良性疾病患者、胃癌患者的cfDNA 平均水平分别为181.90、244.42、1475.92 μg/L，胃癌患者cfDNA 水平显著高于健康者，进一步验证了cfDNA 水平有望成为胃癌诊断的生物学标志物。然而，cfDNA 在血液循环中并不稳定，代谢途径尚未被完全阐明；且特异性不高，在炎性疾病、心血管疾病中水平也会有所升高。cfDNA 的这些特点均限制了其临床应用。

②cfDNA 甲基化：DNA 甲基化指在DNA 甲基转移酶的作用下，将甲基选择性添加到胞嘧啶上形成5-甲基胞嘧啶，属于表观遗传学改变。其在基因转录水平调控基因表达，调控细胞周期、DNA 修复、凋亡和特定的信号网络，参与肿瘤的发生、发展。启动子异常甲基化被认为是胃癌潜在的分子标志。Wang等[9]通过定量甲基化特异性PCR 法检测82例胃癌患者、46 例慢性萎缩性胃炎患者和40 名健康对照者血清中不同基因启动子的甲基化状态，发现胃癌患者UCHL1、FLNC、THBS1 和DLEC1 启动子的甲基化水平明显高于其他组别。Xue 等[10]发现胃癌患者血清中RASSF10 启动子的甲基化水平显著高于健康对照者。说明血清UCHL1、FLNC、THBS1 和DLEC1、RASSF10 启动子甲基化有望作为胃癌诊断的生物学标志物。部分抑癌基因甲基化也参与胃癌的发生。Pimson 等[11]发现胃癌患者血循环中抑癌基因PCDH10和RASSF1A甲基化阳性率高于健康人群，提示血浆PCDH10和RASSF1A 甲基化同样有望成为胃癌诊断的生物学标志物之一。

部分细胞周期相关基因甲基化同样参与胃癌的发生。Septin9 是一种细胞周期相关蛋白，参与细胞分裂，Septin9 基因甲基化与多种恶性肿瘤的发生相关。王炳龙等[12]研究发现，在2128例受检者(包括结直肠癌、胃癌、消化系统良性病变患者和健康受试者)中采用PCR荧光法检测血浆Septin9基因甲基化程度，胃癌患者Septin9 基因甲基化的阳性率为43.71%，敏感性、特异性分别为43.71%、95.12%。说明Septin9基因甲基化对胃癌具有诊断价值。

2.胃液DNA：胃液中存在丰富的胃黏膜细胞，但胃液酸性较强（pH 值＜3），胃液DNA 易被降解，常用胃灌洗液或外泌体检测胃液DNA[13]。胃灌洗液指胃镜检查时用0.9%NaCl溶液灌洗胃黏膜，得到内含大量胃黏膜脱落细胞和肿瘤脱落细胞。外泌体是由细胞分泌到胞外的囊泡，携带来源细胞的遗传物质，可通过超速离心法、聚合物沉淀法等方法分离得到[14]。Watanabe 等[15]胃癌细胞株的研究从31 个靶基因中筛选出6 个甲基化频率较高的基因，分别为MINT25、RORA、GDNF、ADAM23、PRDM5、MLF1，其中，MINT25 甲基化对胃癌的诊断价值最高，诊断胃癌的AUC、敏感性和特异性分别为0.961、90%和96%。Yamamoto 等[16]对胃癌细胞株外泌体和胃癌患者胃灌洗液的研究结果发现BARHL2 基因甲基化可以区分胃癌患者与健康个体。其中，外泌体BARHL2甲基化诊断胃癌的AUC 为0.923，敏感性、特异性分别为90%、100%。

四、非编码RNA

微RNA（microRNA, miRNA）、环状RNA（circular RNA,circRNA）等非编码RNA 通过调控基因表达、参与体内生理和肿瘤等病理过程，其不易降解、稳定性佳，有潜力作为肿瘤诊断的生物学标志物。

1. MiRNA：MiRNA 是由20～25 个核苷酸组成的非编码小RNA，主要在转录后水平发挥基因表达调控作用，参与细胞增殖、分化和凋亡等过程。MiRNA 具有组织特异性，在肿瘤中存在异常表达，有潜力作为胃癌诊断的生物学标志物。

①血浆miRNA：Tsujiura 等[17]分析了69 例胃癌患者和30 名健康对照者血浆中miRNA 水平，发现血浆miR-17-5p、miR-21、miR-106a和miR-106b水平在胃癌患者中表达上调，而血浆let-7a 水平在胃癌患者中表达下调（表1），血浆miR-106b 、miR-106a 联合let-7a 水平诊断胃癌的AUC 分别为0.721、0.879。另有研究发现，胃癌患者较健康人群血清中miR-206 表达下调，其诊断胃癌的敏感性、特异性分别为78%、86%[18]；胃癌患者血浆中miR-376c 表达上调，其敏感性、特异性分别为71.0%、78.0%[19]。联合多种miRNA 检测可提高其对胃癌的诊断效能。Zhu 等[20]研究发现，5 种血浆miRNA（miR-16、miR-25、miR-92a、miR-451和miR-486-5p）在所有类型胃癌患者中均表达升高。

表1 在胃癌患者中差异表达的miRNA和蛋白

②胃液miRNA：多项研究[21-23]以实时定量PCR 和测序法测定99例健康或良性胃疾病、42例胃癌患者胃液miRNA，发现胃癌患者胃液中miR-21、miR-106a、miR-129-1-3p、miR-129-2-3p、miR-421的表达均下降（表1），其中miR-21和miR-106a诊断价值最佳。MiR-21诊断胃癌的AUC 为0.969，敏感性、特异性分别为85.7%、97.8%；miR-106a 诊断胃癌的AUC为0.871，敏感性、特异性分别为73.8%、89.3%。

③唾液miRNA：胃癌患者唾液中同样存在miRNA 的差异表达，其中有6 种miRNA（miR-140-5p、miR-374a、miR-454、miR-15b、miR-28-5p 和miR-301a）下调（表1），其诊断胃癌的AUC波动于0.79～0.88[24]。

④尿液miRNA：尿液中miRNA 可能来源于循环游离miRNA 或由泌尿系统细胞分泌，可以单体形式稳定存在、以蛋白质-RNA复合体存在，或存在于外泌体中。Kao等[25]在胃癌患者尿液的研究中发现，即便在很少的尿液标本中，胃癌患者尿液中miR-21-5p 水平明显升高；而当切除胃癌组织后，尿液标本中miR-21-5p 水平明显下降，提示尿液miR-21-5p 有期望成为胃癌诊断的生物学标志物之一。Iwasaki 等[26]在197 例胃癌患者和175 名健康人的尿液研究中，发现胃癌患者尿液中存在22 种差异表达的miRNA，其中尿液miR-6807-5p 和miR-6856-5p 在胃癌患者中呈高表达（表1），差异有统计学意义，可单独作为诊断标志物，其诊断胃癌的AUC分别为0.867、0.707。若联合尿液miR-6807-5p、miR-6856-5p水平和幽门螺杆菌感染阳性，其识别胃癌的AUC为0.885，敏感性、特异性分别为76.9%、88.9%。

2.CircRNA：CircRNA 呈封闭环状结构，调控基因表达，可影响肿瘤的发生、发展和转移，在许多癌症中均存在差异表达，有潜力作为胃癌诊断的生物学标志物之一。

①循环circRNA：Sun 等[27]采用实时定量PCR 技术检测血浆circRNA 水平，在45 例胃癌患者和17 名健康对照者中，发现胃癌患者血浆中circ_0000520 表达下调，其诊断胃癌的AUC 为0.8974，敏感性、特异性分别为82.35%、84.44%。Shao 等[28]发现39 例胃癌患者血浆中circ_0065149 水平显著低于41 名健康个体，其诊断胃癌的AUC 为0.64，敏感性、特异性分别为48.7%、90.2%。

②胃液circRNA：胃液中一些circRNA 可作为胃癌诊断的生物学标志物。Shao 等[29]的研究发现，胃癌组织中有308种circRNA较正常组织存在差异表达，其中107种circRNA 表达上调、201种表达下调。排名前十位表达上调的circRNA分别为hsa_circ_0035445、_0003789、_0063809、_0074362、_0006282、_0011107、_0084606、_0005556、_0050547、_0006470，前十位表达下调的为hsa_circ_0007099、_0001897、_0007707、_0008832、_0001546、_0002089、_0004680、_0000154、_0004458、_0008394。此外，hsa_circ_0014717可以稳定存在于胃液，便于临床检测，在77.2%（74/96）的受检胃癌组织中均表达下调，有望作为胃癌诊断的生物学标志物。

五、蛋白

蛋白是组成人体细胞、组织的重要组分。不同于基因组的相对静态，蛋白的基因表达具有一定变化，在生理和肿瘤等病理条件下表达不同，有潜力作为胃癌筛查的生物学标志物。

1.血浆蛋白：胃癌患者存在血浆蛋白的差异表达。Zhou等[30]采用液相色谱结合串联质谱标签法，发现胃癌患者中存在差异表达的11 种血浆蛋白（其中P08493、Q9H939、A0A087WTY6、A0A0G2JMC9、P14207、Q86UD1、Q8NBP7 表达上调，而P00441、P16157、P62979、A0A2R8Y7X9 表达下调；表1），其诊断胃癌的AUC 波动于0.573～0.813，敏感性为46.7%～93.3%，特异性为53.3%～100%。若联合这11 种血浆蛋白，其诊断胃癌的AUC 为0.711，敏感性和特异性分别为66.7%和86.7%。

此外，研究发现癌症患者存在一些特异性血清学自身抗体，这些抗肿瘤相关抗原的自身抗体一般采用血清蛋白质组分析法进行检测，也可用于肿瘤筛查[31]。Liu 等[32]发现胃癌患者自身抗体14-3-3 ζ 阳性率显著高于健康对照者（17.6%对2.4%），提示14-3-3 ζ 可作为胃癌的血清学标志物。Qin等[33]采用免疫分析法检测465例胃癌患者和465名健康对照者血清抗14-3-3 ζ 抗体，验证了其在中国人群胃癌患者中阳性率较高，诊断胃癌的AUC为0.627。

Tsunemi等[34]的研究对胃癌患者和健康人群中葡萄糖调节蛋白（glucose-regulated protein,GRP）78 抗体进行分析，发现胃癌患者该抗体阳性率为28.3%（17/60），而健康人群中为0，提出GRP78 可作为胃癌的潜在生物学标志物。Qin 等[35]以133 例胃癌患者、133 名健康人作为试验组，300 例胃癌患者、300 名健康人为验证组，发现两组中国人群中胃癌患者抗GRP78 抗体水平均高于健康个体，该抗体对诊断胃癌的AUC分别为0.718和0.666。

2.胃液蛋白：Kon等[36]发现胃癌患者胃液中60种蛋白分子表达上调、46 种蛋白分子表达下调，其中胃蛋白酶A 和胃蛋白酶原C活性肽段表达明显上调，抵抗素样分子-α表达明显下调。Chang 等[37]发现胃液中5 种蛋白在胃癌患者中存在差异表达，其中2种胃蛋白酶原片段和亮氨酸拉链蛋白片段水平降低，白蛋白和α-1 抗胰蛋白酶片段水平升高（表1）。Hsu等[38]的研究同样发现胃癌患者胃液中α-1抗胰蛋白酶水平升高，其诊断胃癌的AUC 为0.96，敏感性、特异性分别为96%、92%。

3. 唾液蛋白：唾液蛋白也可用于胃癌筛查。Koopaie等[39]研究发现，与31 名健康人相比，31 例胃癌患者中唾液蛋白胱抑素B 表达明显降低、脑恶性肿瘤缺失蛋白1 表达明显增高（表1）。若以胱抑素B＜119.06 μg/L作为阳性临界值，其诊断胃癌的AUC 为0.728，敏感性、特异性分别为83.87%、70.97%。若以脑恶性肿瘤缺失蛋白1>146.33 μg/L 作为阳性临界值，其诊断胃癌的AUC 为0.741，敏感性、特异性分别为80.65%、64.52%。

4. 尿液蛋白：Shimura 等[40-41]的多项研究发现，尿液三叶因子1（urinary trefoil factor 1, uTFF1）、尿液解整合素样金属蛋白酶12（urinary a disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 12,uADAM12）、尿液胃蛋白酶原3（urinary pepsinogen 3,uPGA3）、尿液BRCA1 相关环域蛋白1（urinary BRCA1-associated RING domain 1, uBARD1）、尿液基质金属蛋白酶-9/中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白复合体（urinary matrix metalloproteinase-9/neutrophil gelatinaseassociated lipocalin complex,uMMP-9/NGAL）在胃癌患者中表达升高（表1）。其中，uTFF1、uADAM12、uMMP-9/NGAL差异有统计学意义（P＜0.05），uTFF1、uADAM12 诊断胃癌的AUC分别为0.806、0.714，可单独作为胃癌诊断生物学标志物。若联合uTFF1、uADAM12 诊断胃癌，其AUC 为0.815；联合uMMP-9/NGAL、uADAM12，AUC则为0.825。

六、总结

不同来源的生物学标志物各有优缺点。血液采集方法成熟、创伤相对较小、可重复性较高，但血液中成分相对复杂，需避免其他物质干扰。胃液直接来源于病变区域，生物学标志物特异性和浓度均较高，但胃液的获取仍需要依赖胃镜检查，限制了其大规模推广与应用。唾液与尿液方便获取，但唾液含有DNA、RNA、代谢物和微生物群等多种组分，样品的纯化和避免其他分子的污染仍存在困难[40]；尿液含有多种代谢产物，且浓度会随尿量、药物使用、肾脏病理情况而改变。

胃癌生物学标志物的探索与应用有助于胃癌的筛查和早期诊断，有利于疾病的早期管理。期望在不久的将来，无创或微创生物学标志物可以作为胃癌筛查的常规手段，广泛应用于大规模人群中，从而实现胃癌的早期诊断和治疗，提高患者生存率和生命质量。