益气解毒方联合5-氟尿嘧啶介导NF-κB通路促进裸鼠结肠癌移植瘤凋亡效应的研究

魏行云,罗 欢,刘 灵,曹 蓉,江志超

(1. 湖南中医药大学中西医结合学院,湖南 长沙 410208;2. 湖南省中医药防治眼耳鼻咽喉疾病与视功能保护工程技术研究中心,湖南 长沙 410208;3. 湖南省直中医医院,湖南 株洲 412000)

结肠癌是世界上第三大常见的恶性肿瘤和第二大癌症死亡病因[1]。除了性别、年龄、家族史以外,饮食习惯、生活方式等因素都可能导致结肠癌的发生[2]。根据世界卫生组织的数据,目前结肠癌的主要治疗策略是手术、化疗、放疗以及免疫治疗,其中一线化疗药物以5-氟尿嘧啶(5-Fu)为主,但是化疗可能出现耐药性,使治疗受到限制[3-5]。中医药立足于整体观念,在改善肿瘤患者症状、提高患者生活质量、抑制肿瘤生长、延长患者生存期方面显示出很好的疗效[6-8]。益气解毒方是由田道法教授在多年临床经验基础上研发的治疗鼻咽癌的经验方,具有扶正祛邪、气阴双补、益气解毒的功效,可以抑制鼻咽癌细胞增殖、迁移侵袭,诱导其凋亡[9-11]。本课题组前期研究发现,益气解毒方可抑制结肠癌HCT-116细胞增殖及促进其凋亡[12]。本实验通过构建结肠癌移植瘤模型,旨在探索益气解毒方、5-Fu单用及联用在体内的抑瘤效果及其可能作用机制,为结肠癌的临床治疗提供更好的方法和实验依据。

1 实验材料与方法

1.1细胞株 人结肠癌细胞株HT-29,购于北京北纳创联生物技术研究院,批号:19071806。

1.2实验动物 健康BALB/c裸鼠40只,4～5周龄,雌雄各半,购于北京华阜康生物科技股份有限公司,动物质量许可证号:SCXK(京)2019-0008。裸鼠饲养于湖南中医药大学动物中心SPF级小鼠房中,保持恒温20～25 ℃,相对湿度50%～70%,实验单位使用许可证编号:SYXK(湘)2019-0009。本实验经湖南中医药大学动物伦理委员会审查通过(LLBH-202111180001)。

1.3主要药物 益气解毒方,由黄芪15 g、黄连10 g、党参10 g、白花蛇舌草20 g、天花粉15 g、茯苓10 g、甘草6 g组成,饮片购于湖南中医药大学第一附属医院。按人与裸鼠体重折算等效剂量换算公式[13]计算给药量:裸鼠剂量(g/kg)=12.5×[成人剂量(g)/成人体重(70 kg)]。将中药饮片浸泡1 h,武火煮沸转文火煎40 min取药液,所剩药渣按前法再煎1次,将2次药液混匀后过滤,浓缩成15 g/kg(1倍剂量)水煎剂,4 ℃保存备用。5-Fu,金耀药业有限公司,国药准字H12020959,参考吴坚等[14]方法并结合本课题组前期预实验,将5-Fu用生理盐水稀释配成5 mg/mL的溶液,避光,4 ℃保存备用。

1.4主要试剂与仪器 RPMI-1640培养基(普诺赛公司,批号:PMI50110);青霉素-链霉素溶液(普诺赛公司,批号:PB180120);0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液(含酚红,索莱宝公司,批号:T1324);胎牛血清(普诺赛公司,批号:164210-50);BCA蛋白定量试剂盒(联科生物公司,批号:70-PQ0012);超纯总RNA提取试剂盒(新景生物公司,批号:5003050);彩虹180光谱蛋白Marker (11-180KD,索莱宝公司,批号:PR1910-2);苏木素染液(Biosharp公司,批号:BL702A);肿瘤坏死因子-α(TNF-α)抗体(武汉三鹰生物技术有限公司,批号:HZ-1014); β-actin、B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白(Bax)、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、IκK、IκB、核转录因子-κB(NF-κB)p65抗体(CST公司,批号分别为3700S、5023P、2870S、8943S、4814S、6956S);4%多聚甲醛(Biosharp公司,批号:BL539A)。正置显微镜(德国徕卡公司,型号:DM2700M);CO2培养箱(美国赛默飞世尔公司),正置显微镜(德国徕卡公司,型号:DM2700M);CO2培养箱(美国赛默飞世尔公司,型号:HERAcell150i);石蜡切片机(德国徕卡公司,型号:HistoCore BIOCUT);高速冷冻离心机(德国Beckman Coulter公司,型号:MRZ16A022);酶标仪(美国BioTek公司,型号:ELX800)。

1.5细胞培养方法 将HT-29细胞培养于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中,置于37 ℃、5%CO2的恒温细胞培养箱中培养。

1.6实验方法 裸鼠适应性喂养1周后,参考张硕秋[15]方法,提前消化对数生长期的HT-29细胞,并用提前预冷的PBS重悬,调整细胞密度为1×107个/mL,在半小时内取0.2 mL上述混合液接种于裸鼠左侧腋窝后部同一位置、同一深度。接种3 d后观察裸鼠接种处的成瘤情况,每3 d记录1次体重、瘤体大小,待皮下瘤直径约5 mm时即造模成功。 模型建立成功后,选取肿瘤直径平均为10 mm的移植瘤鼠40只,按随机数字表法平均分为4组,每组10只。模型组给予0.2 mL生理盐水灌胃,益气解毒方组给予15 g/kg益气解毒方0.2 mL灌胃,5-Fu组给予5 mg/mL的5-Fu溶液0.2 mL腹腔注射,联合组给予15 g/kg益气解毒方0.2 mL灌胃及5 mg/mL的5-Fu溶液0.2 mL腹腔注射。各组均于每天10:00干预,灌胃每天1次,腹腔注射每2 d 1次,连续干预25 d。

1.7检测指标及方法

1.7.1移植瘤鼠一般情况 每天观察移植瘤鼠一般情况,如饮食、精神、活动状态等。

1.7.2移植瘤体积 各组干预后每3 d测量1次肿瘤最长径a和最短径b,根据V=ab2/2计算肿瘤体积,绘制移植瘤生长曲线。

1.7.3瘤组织病理学形态 各组移植瘤鼠末次干预2 h后颈椎脱臼处死,解剖剥离肿瘤,拍照,称重。部分用4%多聚甲醛固定,常规脱水、石蜡包埋、切片后,进行脱蜡处理、苏木素染细胞核、伊红染细胞质、脱水透明、显微镜观察、图像采集分析。

1.7.4瘤组织中凋亡及NF-κB信号通路相关蛋白表达情况 采用Western blot法检测:取液氮中冻存的肿瘤组织块,用剪刀尽可能剪碎,置于1.5 mL离心管中,加入含1%PMSF的RIPA裂解液及适量组织研磨珠后,将离心管放入组织研磨机中研磨10 min。将液体转移至1.5 mL离心管中,放于4 ℃冰箱静置裂解30 min。再将离心管置于高速离心机中,4 ℃、12 000 r/min离心10 min,收集上清,BCA法测定蛋白浓度。每组取90 μg蛋白,电泳后将蛋白转移至PVDF膜上,封闭液封闭1 h,加入对应的一抗4 ℃过夜,避光孵育二抗1 h,用Image Studio显影并进行灰度值分析。

1.7.5瘤组织中Bax、NF-κBp65、TNF-α蛋白表达情况 采用免疫组化法检测:将各组肿瘤组织石蜡切片放入二甲苯中浸泡2次,每次10 min;无水乙醇浸泡2次,每次5 min;95%乙醇浸泡5 min;90%乙醇浸泡5 min;80%酒精浸泡2 min;70%酒精浸泡2 min;蒸馏水浸洗2 min。加热组织修复液至95 ℃左右,放入切片1 min,冷却,再反复1次。封闭液室温下封闭20min,将多余的液体甩掉。滴加一抗,4 ℃过夜。PBS洗切片3次,每次5 min。加入二抗,室温孵育30 min。PBS洗3次,每次5 min。加入DBA显色液,室温下显色,阳性信号为棕黄色或棕褐色。用蒸馏水冲洗3次。苏木素轻度复染,梯度酒精脱水,二甲苯透明,风干后中性树胶封片,光学显微镜下观察并拍照,用Image J 2.0软件计算平均光密度值。

1.7.6瘤组织中Bax、Caspase-3、NF-κBp65 mRNA表达情况 使用超纯总RNA提取试剂盒提取肿瘤组织总RNA,测定RNA浓度及纯度后,将RNA反转录为cDNA,配制RT-qPCR反应体系:NovoStart®SYBRqPCR Super Mix Plus 10 μL,上、下游引物各1 μL,cDNA 2 μL,加DEPC水至总体积20 μL。反应条件:95 ℃预变性1 min;95 ℃ 20 s,60 ℃ 1 min,共45个循环;95 ℃变性15 s,60 ℃退火60 s。以β-actin为内参,采用2-ΔΔCT法进行相对定量分析。引物由湖南康合益生物科技有限公司合成,引物序列见表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.8统计学方法 采用SPSS 25.0软件进行统计分析。若计量资料服从正态分布,多组比较采用单因素方差分析,满足方差齐性,多重比较用LSD检验,方差不齐采用DunnetT3检验;若计量资料不符合正态分布,则采用秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组鼠一般情况 接种HT-29细胞后,各组鼠食欲降低,活动状态较接种前差;各药物组鼠药物干预后进食、精神、活动状态都有所改善。

2.2各组鼠移植瘤生长情况 从药物干预第4天开始,各组鼠移植瘤体积出现差异,模型组移植瘤生长曲线呈现较陡上升趋势,各药物组移植瘤生长曲线较为平缓,联合组移植瘤生长趋势最为平稳;末次灌胃结束后,各药物组移植瘤体积均明显小于同期模型组(P均<0.05),且联合组均明显小于益气解毒方组和5-Fu组(P均<0.05),益气解毒方组和5-Fu组移植瘤体积比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

图1 结肠癌各组鼠移植瘤生长曲线

2.3各组鼠移植瘤病理组织学形态 模型组瘤体结构排列紧密,细胞核均匀,整体的生长状态良好;各药物组均显示出不同程度的瘤细胞体积变小、细胞破裂、坏死,且联合组破坏最明显。见图2。

图2 结肠癌各组鼠移植瘤组织HE染色表现(黑色箭头表示破裂坏死的肿瘤细胞)

2.4各组鼠瘤组织中凋亡相关蛋白和NF-κB信号通路相关蛋白表达情况 与模型组比较,各药物组瘤组织中Bax蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05),Bcl-2、NF-κBp65、IκK、IκB蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05)。与益气解毒方组和5-Fu组比较,联合组瘤组织中Bax蛋白相对表达量均更高(P均<0.05),Bcl-2、NF-κBp65、IκK、IκB蛋白相对表达量均更低(P均<0.05),益气解毒方组和5-Fu组各蛋白相对表达量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图3及图4。

图3 结肠癌各组鼠移植瘤组织中凋亡相关蛋白表达情况

图4 结肠癌各组鼠移植瘤组织中NF-κB信号通路相关蛋白表达情况

2.5各组鼠瘤组织中Bax、NF-κBp65、TNF-α蛋白表达情况 免疫组化检测显示,蛋白阳性表达呈棕黄色或棕褐色,Bax分布于细胞质,NF-κBp65分布于细胞质与细胞核(入核发挥作用),TNF-α分布于细胞质与细胞核膜。与模型组比较,益气解毒方组和联合组瘤组织中Bax表达平均光密度值均明显升高(P均<0.05),5-Fu组和联合组NF-κBp65、TNF-α表达平均光密度值均明显降低(P均<0.05);联合组瘤组织中Bax表达平均光密度值明显高于5-Fu组(P<0.05),瘤组织中NF-κBp65表达平均光密度值明显低于益气解毒方组(P<0.05),瘤组织中TNF-α表达平均光密度值与5-Fu组和益气解毒方组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图5及图6。

图5 结肠癌各组鼠瘤组织中Bax、NF-κBp65、TNF-α蛋白表达情况(免疫组化染色)

图6 结肠癌各组鼠瘤组织中Bax、NF-κBp65、TNF-α蛋白表达平均光密度值

2.6各组鼠瘤组织中Bax、Caspase-3、NF-κBp65 mRNA表达情况 与模型组比较,5-Fu组、联合组瘤组织中Bax mRNA相对表达量和各药物组瘤组织中Caspase-3 mRNA相对表达量均明显升高(P均<0.05),益气解毒方组、联合组瘤组织中NF-κBp65 mRNA相对表达量均明显降低(P均<0.05);且联合组瘤组织中Bax 、Caspase-3 mRNA相对表达量均明显高于益气解毒方组和5-Fu组(P均<0.05),瘤组织中NF-κBp65 mRNA相对表达量明显低于5-Fu组(P<0.05);益气解毒方组和5-Fu组瘤组织中Bax 、Caspase-3 mRNA相对表达量、益气解毒方组和联合组瘤组织中NF-κBp65 mRNA相对表达量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 结肠癌各组鼠瘤组织中Bax、Caspase-3、NF-κBp65 mRNA相对表达量比较

3 讨 论

结肠癌属于中医中“积聚”“肠覃”“下血”等疾病范畴,其病位在大肠,病机多为肝脾肾不足、气血阴阳亏虚,夹杂湿热、瘀毒、气机不畅,总体属虚实夹杂、本虚标实[16-17]。中医强调人体是一个有机的整体,五脏六腑和经络循行有密切的联系,手太阴肺经属肺络大肠,手阳明大肠经属大肠络肺,两者互为表里,《灵枢》中记载“手阳明太阴为表里”“肺合大肠,大肠者,传导之府”。中医认识疾病、治疗疾病强调辨证论治,“异病同治”是基于辨证论治的一个重要的中医思想。益气解毒方虽为临床上治疗鼻咽癌的经验方,但是基于《黄帝内经》中提出的“肺与大肠相表里”理论以及“异病同治”理论,本方对结肠癌的治疗应有相同的功效。新时代下经过一系列的实践证明,中西医结合是预防治疗疾病的最佳方法之一。益气解毒方与5-Fu都有抑制肿瘤细胞增殖、迁移侵袭,促进肿瘤细胞凋亡、焦亡、自噬的作用[10,18],二者联合使用有望成为治疗结肠癌的有效新方法。本实验结果显示益气解毒方与5-Fu单用或联用均可有效抑制结肠癌移植瘤的生长。

细胞凋亡是一种程序性细胞死亡形式,可以通过清除恶性或癌前细胞来抑制肿瘤[19]。Bcl-2家族是凋亡通路的核心分子家族,包括了Bcl-2亚家族和Bax亚家族。Bcl-2亚家族成员对细胞凋亡起抑制作用[20],Bax亚家族则促进凋亡[21-22]。Caspase-3蛋白酶属于Caspase家族,是细胞执行凋亡的效应分子[23]。本实验结果显示,与模型组比较,各药物组瘤组织中Bax蛋白相对表达量、Caspase-3 mRNA相对表达量和5-Fu组、联合组瘤组织中Bax mRNA相对表达量均明显升高,各药物组瘤组织中Bcl-2蛋白相对表达量均明显降低,且联合组各蛋白表达改善情况均明显优于5-Fu组和益气解毒方组,提示益气解毒方和5-Fu联合使用可更有效促进结肠癌移植瘤凋亡。

NF-κB是调节炎症、免疫反应、细胞凋亡的关键转录因子,受诸多因子调控,其中包括TNF-α。研究表明,氯化花青素可降低结肠癌细胞内TNF-α的含量,从而抑制NF-κB通路相关蛋白IκB的表达[24]。NF-κB通常与IκB结合形成NF-κB-IκB复合物存在于细胞质中。NF-κB激活后,IκB则被IκK活化,NF-κB-IκB复合物会释放NF-κB到细胞核从而介导各种生物学过程[12,25]。研究显示,NF-κB通路的激活可以增加结肠癌血管生成,促进结肠癌发展[26];抑制NF-κB通路可以抑制结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭[27]。本实验结果显示,5-Fu组和联合组瘤组织中NF-κBp65、TNF-α表达平均光密度值均明显低于模型组,联合组瘤组织中NF-κBp65表达平均光密度值明显低于益气解毒方组;各药物组瘤组织中NF-κBp65、IκK、IκB蛋白相对表达量和益气解毒方组、联合组瘤组织中NF-κBp65 mRNA相对表达量均明显低于模型组,且联合组瘤组织中NF-κBp65、IκK、IκB蛋白相对表达量和NF-κBp65 mRNA相对表达量均明显低于5-Fu组。提示益气解毒方和5-Fu联合使用可明显抑制NF-κB信号通路。

综上所述,益气解毒方联合5-Fu可有效抑制小鼠结肠癌移植瘤生长,促进细胞凋亡,机制可能与下调Bcl-2、TNF-α蛋白和NF-κB信号通路相关蛋白表达,上调Bax、Caspase-3蛋白及mRNA表达有关。本研究为临床上益气解毒方与5-Fu联用治疗结肠癌提供了一定实验依据,为“异病同治”“肺与大肠相表里”理论提供了生物学基础。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。