白色念珠菌鉴定方法学比较及流行病学研究

陈 瑶 郑才斌

福建医科大学附属南平第一医院检验科，福建南平 353000

白色念珠菌（Candida albicans）是一种常见的机会致病菌，常寄生在正常人的皮肤表面、口腔、胃肠道、阴道黏膜等位置而不发生疾病[1-2]。近年来，由于社会老龄化问题愈来愈严重、多种广谱抗生素的滥用、人体免疫功能下降等原因，导致感染白色念珠菌的人数逐年升高[3-4]。调查发现，白色念珠菌是真菌感染常见致病菌，同时也是导致院内获得性念珠菌感染的主要病原体[5-6]。目前有很多方法可用于鉴定白色念珠菌[7-8]，包括基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser-desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）和内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）序列分析方法。MALDI-TOF MS 作为一种新兴的微生物蛋白图谱鉴定系统，因其具有快速检测的优势，近年来逐渐受到广泛关注[9]。分析比较不同科室分离的白色念珠菌的亲缘关系，可以清楚的看出它的传播特点和流行情况，为有效抑制真菌扩散与感染爆发提供依据。因此，准确、快速地诊断念珠菌感染以及对其进行流行病学调查，对于预防和治疗侵袭性真菌感染具有重要的临床价值。本研究通过回顾性分析2011 年1 月至2016年12 月临床无菌部位分离的白色念珠菌，分别用不同方法鉴定并进行比较分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 标本来源

回顾性分析2011 年1 月至2016 年12 月福建医科大学附属南平第一医院从临床无菌部位（血液、脑脊液、胸腹水、穿刺液、引流液等）分离出的173 株白色念珠菌，均为各个科室送检的血培养阳性念菌株；均进行同样的方式检验；将同一患者同一部位检出的标本或者同一患者不同部位反复检出的相同标本剔除，记录好患者的基本资料和菌株信息。

1.2 方法

1.2.1 菌株鉴定 将收集到的菌株进行复苏，沙保罗琼脂平板在35℃孵育箱培养24 ～48 h，挑选菌落进行MALDI-TOF MS（德国布鲁克公司）鉴定和ITS 测序鉴定。

1.2.2 同源性分析

1.2.2.1 多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST） （1）引物合成：从http://www.mlst.net/网站中获取7 个管家基因位点的引物信息，委托英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。引物信息见表1。

表1 白色念珠菌7个管家基因的片段长度和引物序列

用以上引物进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增，并行琼脂糖凝胶电泳，再将扩增后的阳性产物送至铂尚生物技术有限公司进行测序，就可得到菌株的序列型（sequence typing，ST 型）和基因位点分型。

（2）系统发育分析：①基于位点序列的系统发育分析。用clustalX 软件，将上述测序数据进行比对，然后用MEGA4 软件进行菌株的序列多重比对，最后用邻接法、最大简约法等构建进化树。②基于位点型别的系统发育分析。用eBURST 的方法，将上述得到的7 个管家基因的基因位点型别进行聚类分析，至少有4 个基因位点相同的型别可分到同一eBURST 群中。

1.2.2.2 MALDI Biotyper 同源性分析 （1）聚类分析[主谱图预测（main spectra projection，MSP）]：125 株菌株可以生成125 个MSP，Selected MSP 窗口下选中全部MSP，右击MSP Dendrogram，即可生成聚类分析图。

（2）主成分分析（principal compontent analysis，PCA）：分析菌株的原始数据，结果用View Clustering 图形显示。

1.3 统计学分析

实验数据采用SPSS 22.0统计学软件进行处理，计量资料以均数±标准差（）表示，采用t检验，计数资料以[n（%）]表示，用χ2检验，P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ITS测序结果

通过ITS 测序鉴定后，173 株白色念珠菌只有125 株鉴定准确，PCR 电泳图见图1。

2.2 不同鉴定方法的结果比对

通过不同方法鉴定后，173 株白色念珠菌只有125 株鉴定准确，结果见表2。

表2 不同鉴定方法的结果比较

2.3 白色念珠菌的菌株分布特征

用上述方法鉴定准确的125 株白色念珠菌，分别来自125 例不同患者，男83 例（83/125，66.40%），女42 例（42/125，33.60%），年龄中位数为59 岁，平均（51.35±6.54）岁。引流液和血液是标本来源中最多的两种类型，分别占43 例（43/125，34.40%）和40 例（40/125，32.00%），最少的为脑脊液（1/125，0.80%）。科室分布中以重症医学科占最多有47 例（47/125，37.60%），排在第二的为基本外科占21 例（21/125，16.80%）。

2.4 MLST分型

125 株白色念珠菌经MLST 分型后可得到61 个序列型（ST 型），其中最多的序列型为ST3160（8 株）和ST1474（9 株），其次是ST2059（7 株）和ST1450（7株）。在7 个管家基因位点中，VPS13 基因与SYA1基因依次分出24 个和19 个型别，分型效率居前两位，ACC1 基因分出8 个型别，分型效率最低。

3 讨论

多年来，深部真菌一直是院内感染的关键致病微生物之一。对年龄分布的分析表明，60 ～79 岁年龄段的患者数量最多，占总数的一半以上，其中60 ～69 岁患者占比高达24.80%。这一趋势与已有文献的研究结果一致[10-11]，强调了老年人更容易感染白色念珠菌的事实。这一现象可以追溯到多个因素：首先，老年人随着年龄增长，各个器官系统的功能逐渐减弱，是感染高发群体；其次，老年人通常伴随多种基础性疾病，可能服用影响免疫的药物，或因住院时间较长而接受侵入性操作，这些因素都导致免疫功能的下降，促使真菌在体内滋生，引发二次感染[12]。值得特别强调的是，在本研究中，源自血液感染的白色念珠菌感染占比高达32.00%。根据报道[13]，真菌血症病死率最高可超过70%，早期及时对疑似感染患者行真菌镜检及培养是挽救生命体的关键。本研究发现白色念珠菌感染的发病率在不同临床科室之间存在差异，其中重症医学科的发病率最高，达到37.60%，这与先前的文献报道[14]一致。在重症医学科，白色念珠菌高发的主要原因是医源性因素，如气管插管、中心静脉导管的置入、留置导尿管等侵入性操作，外科大手术等。此外，基本外科科室中，肝胆外科检出率也相对较高，通常伴随创伤性大手术。因此，迫切需要寻找快速而准确的鉴定方法，以便对真菌感染进行诊断和治疗。

本研究结果表明，针对致病性念珠菌的鉴定，MALDI-TOF MS 与ITS 测序结果相比，在准确性上无明显差异，但其具有更短的检测时间和更低的成本，因此被视为一种迅速、便捷、精确的鉴定方法。有研究者认为，真菌科玛嘉显色培养存在技术局限，可能导致误导性的鉴定和治疗错误。原因分析：①不同人对颜色的分辨能力存在差异，导致对于类似的颜色，如紫红色、蓝色、蓝灰色、蓝紫色的识别存在差异；②常见菌株在科玛嘉显色后的颜色可能缺乏典型；③研究中所包含的不同菌种构成比例不同；④少见与常见菌株的相似性。这反映了科玛嘉显色培养方法在结果解释方面存在一定的主观性，容易导致误判情况的发生。因此，为了获得准确的结果，需要将科玛嘉显色培养与其他鉴定方法结合使用[15-16]。

以MALDI-TOF MS 鉴定念珠菌，方法和原理完全有别于传统方法，不再需要提取DNA 和测序。鉴别单个样本所需的时间仅为几分钟，极大地提高了工作效率，成本低且操作简便。在本研究中，此法鉴定念珠菌级别准确度高达100.00%，并且与ITS 测序结果完全一致。这一结果与已有文献研究[17]的结论一致，肯定了此法鉴定精准、低成本、高效率的特点。

分子生物学技术在临床和科研领域得到广泛应用，通常被视为评估其他真菌鉴定方法的“黄金标准”。本研究通过ITS 测序准确地确定了酵母样真菌的种属，覆盖了12 个不同的真菌种类。尽管分子生物学技术在真菌鉴定方面取得了显著进展，但仍存在一些挑战。真菌基因数据库尚不完善，同时，不同真菌DNA 提取尚缺乏统一规范，这可能导致较高的成本和较长的操作时间。因此，许多临床实验室目前尚未具备进行这项技术的实验条件，相关研究尚处于实验阶段，尚未在临床实践中得到广泛应用。

综上，MALDI-TOF MS 鉴定念珠菌准确度与ITS 测序相近，而且具有更高的效率、较低的成本，是一种快速、便捷、准确的致病性念珠菌鉴定方法。此外，两种方法的同源性分析结果基本一致，这表明在临床实验室中广泛采用MALDI-TOF MS 是合理的。然而，本研究也存在一些限制，包括样本数量有限和研究时间较短。未来的深入研究将有助于更全面地验证MALDI-TOF MS 在念珠菌鉴定中的准确度。