基于网络药理学及分子对接研究桂芍葛芎汤治疗偏头痛的作用机制

徐利飞 陆素琴 李 慧 董秋平

南京中医药大学镇江附属医院 镇江市中医院，江苏镇江 212000

偏头痛是以反复发作的单侧搏动性头痛为主要临床表现，常合并有恶心呕吐、畏声光电刺激等伴随症状[1]。偏头痛常见于青春期起病，女性居多，发病年龄在35 ～39 岁达到高峰[2]。近年来偏头痛呈逐年增高的趋势，有研究显示[3]，约50%的患者长期受偏头痛困扰，患者正常生活和工作效率发生改变，而30%的患者头痛发作时根本无法生活和工作。目前西医治疗偏头痛以药物缓解疼痛症状为主，长期使用疗效不佳，易造成药物过度性偏头痛。中医药治疗偏头痛历史悠久，长期的临床实践以及临床试验研究肯定了中医药的疗效和安全性[4]。

桂芍葛芎汤是由镇江市名中医陆素琴教授在经典名方桂枝加葛根汤的基础上化裁而成，临床上常用于血瘀寒凝型偏头痛的治疗，并取得满意疗效。鉴于该组方药物多、活性成分复杂，本研究通过网络药理学对桂芍葛芎汤治疗偏头痛的“药物活性成分-潜在靶标-作用通路”进行预测性分析，并将靶点基因进行分子对接验证，旨在为桂芍葛芎汤治疗偏头痛的深入研究提供科学的参考依据。

1 资料与方法

1.1 桂芍葛芎汤活性成分靶点和偏头痛靶点筛选

通过TCMSP 对桂芍葛芎汤进行活性成分检索筛选。筛选条件设置为口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，类药性（drug-likeness，DL）≥0.18。利用GeneCards、GEO、DisGenet 以及OMIM 数据库，筛选条件：检索词设置为“migraine”进行靶点检索，获取偏头痛的相关疾病靶点。

1.2 桂芍葛芎汤治疗偏头痛靶点筛选

将所得到的药物靶点与疾病靶点分别输入Venny 2.1 软件，并制作韦恩图，得到桂芍葛芎汤和偏头痛的共有靶点。

1.3 蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络构建及关键靶点筛选

将药物和疾病的共有靶点输入数据库（STRING）进行PPI 网络的构建，制作PPI 的网络图谱。将STRING 数据库获得的TSV 文件导入到CytoScape 3.7.2 软件，将得到的PPI 网络进行分析，进而筛选出化合物作用于疾病的关键靶基因。

1.4 中药-化合物-靶点网络构建

为了解中药、化合物和相应靶点之间作用关系，构建中药- 化合物- 靶点- 通路- 疾病网络图，并导入CytoScape 3.7.2 软件中进行网络图的制作。

1.5 交互靶点基因本体（gene ontology，GO）和京都基因组与基因组百科全书通路（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析

将药物与疾病共有靶点导入DAVID Bioinformatics Resources 6.8 进行GO 和KEGG 通路富集分析，富集条件为默认原始设置，靶点KEGG 通路富集分析，以P＜ 0.05 有统计学意义标准进行筛选。

1.6 分子对接

将桂芍葛芎汤各药物的核心靶点与关键活性成分进行分子对接，验证两者的结合能力，采用Discovery Studio 软件对Docking Score 绝对值≥5的对接分子构建3D 模型。

2 结果

2.1 桂芍葛芎汤成分靶点和偏头痛靶点筛选结果

通过对桂芍葛芎汤成分靶点筛选，共得到中药活性成分共104 个。利用PubChem 数据库对104个活性成分分别进行检索，筛选得到药物靶点958个。通过对偏头痛靶点筛选，对检索到的疾病相关靶点进行合并、去重，得到疾病靶点3736 个。

2.2 桂芍葛芎汤治疗偏头痛靶点韦恩图绘制

对筛选出的疾病靶点与药物靶点进行韦恩图的绘制，得到416 个共有靶点，见图1。

图1 化合物-疾病共有靶点可视化

2.3 PPI网络构建及关键靶点筛选结果

药物和疾病共有靶点绘制的PPI 网络图，其中416 个节点，6492 条边，平均度值为31.2。将PPI 网络拓扑分析，依据Degree 值排名筛选出桂芍葛芎汤作用于疾病的关键靶基因。见图2 ～3、表1。

表1 关键靶点筛选结果

图2 中药-疾病共有靶点网络图

图3 中药-疾病共有靶点PPI 网络图

2.4 中药-化合物-靶点网络构建

以中药、化合物和作用靶点为基础，构建了中药- 化合物- 靶点- 通路- 疾病网络图。见图4。

图4 中药-成分-靶点网络

2.5 靶点的功能及通路分析

2.5.1 GO 富集功能分析 GO 富集功能分析共有924个条目。其中包括细胞成分（cellular component，CC）142 个，生物学过程（biological processes，BP）1053个，分子功能（molecular function，MF）252 个。运用微生信对排名前十的富集条目进行可视化分析，见图5。其中横坐标表示靶点数，P值越大则越偏向蓝色，左侧表示BP、CC、MF，P值越小颜色越偏向红色。

图5 交互靶点GO 功能富集分析

2.5.2 KEGG 富集功能分析 KEGG 富集功能分析共有180 条信号通路。运用微生信对排名前十的富集条目进行可视化分析。主要与神经活性配体-受体相互作用、血清素能突触、钙信号通路、环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）信号通路、癌症的途径、前列腺癌、糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路、EGFR 酪氨酸激酶抑制剂耐药性、卡波西肉瘤相关的疱疹病毒感染、内分泌抵抗、乙型肝炎、人巨细胞病毒感染、胰腺癌、氮代谢、膀胱癌、化学致癌作用-受体激活、脂质和动脉粥样硬化、Rap1 信号通路、FoxO 信号通路、急性髓系白血病等过程相关，见图6，其中横坐标表示基因的数量，左侧表示各通路名称，颜色表示P值，P值越小越偏向红色，P值越大则越偏向绿色。

图6 KEGG 通路富集分析结果

2.6 分子对接

为检验关键靶点结构和关键活性成分结构的稳定性，进行分子对接验证。两者结合能力的强弱用Affinity 值表示，配体和受体的结合越稳定，则结合能力越低。表2 和图7 ～8 显示了核心靶点的结合能力及ALB 的结合模式。

表2 关键靶点结合能力（kcal/mol）

图8 基于分子对接ALB 和formononetin 的结合模式

3 讨论

中医关于偏头痛早有记载，《内径》称之为“头风”“脑风”等，中医认为偏头痛病因不外乎内感和外伤两大类。头为“精明之府”“诸阳之会”，外邪可以直接侵袭头部，经脉痹阻而发为头痛；内伤久病，正气虚衰，脑脉失于濡养，则不荣则痛。本病中医治疗原则以温经散寒，活血化瘀为大法。相比西医治疗而言，中医疗法能明显减少头痛发作频次，显著改善头痛程度，具有安全性高，副作用小的优势[5]。桂芍葛芎汤是在经典名方桂枝加葛根汤的基础上加减配伍而成，临床疗效颇丰，现将该组方治疗偏头痛可能的作用机制进行网络药理学分析，研究结果如下。

通过本研究得到桂芍葛芎汤药物靶点958 个，涉及活性成分共104 个。偏头痛靶点3736 个，桂芍葛芎汤治疗偏头痛的潜在作用靶点416 个。在桂芍葛芎汤诸多活性成分中，花旗松素、β-谷甾醇、谷甾醇、儿茶酚、过氧麦角甾醇等活性成分在治疗偏头痛的过程中发挥了重要作用。花旗松素（toxifolin）又名二氢槲皮素、紫叶杉素，是一种天然抗氧化剂，被称为“清基之王”，具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎等多种药理活性[6]。研究表明，花旗松素可降低血液的黏稠度，改善毛细血管微循环，从而达到改善头痛的作用[7]。β-谷甾醇具有显著的抗氧化性、抗炎性，可使细胞中白细胞介素（interleukin，IL）-6、IL-8、IL-1β 等因子减少，进而减轻头痛的炎症反应[8]。

通过相关靶点PPI 网络分析发现，桂芍葛芎汤治疗偏头痛排名前五的核心靶点基因包括白蛋白（albumin，ALB），肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF），IL-6，苏氨酸蛋白激酶（threonine protein kinase，AKT1），甘油醛-3- 磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）。炎细胞因子TNF、IL-6 参与偏头痛的病理生理学过程，并且与中枢神经系统痛觉关系紧密[9-10]。有研究表明，由于头痛患者体内细胞免疫应答吞噬和杀伤能力降低，引起体内细菌脂多糖增加，进而诱导TNF 和IL-6 的释放过量，引发神经源性炎症，参与神经源性疼痛[11]。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)1 存在于人外周血单核细胞中，为评价炎症的重要指标之一，与炎症密切相关，通常是炎症各种通路的一份子[12]。由此表明，通过相关靶点PPI 网络分析可以看出桂芍葛芎汤治疗偏头痛具有多靶点特点。

通过对桂芍葛芎汤治疗偏头痛的通路富集分析可以得出，在诸多通路中，癌通路是其中复杂且重要的通路之一，包含了IL-6、核因子（nuclear factor，NF）-κB、MAPK 和PI3K/AKT 等通路。有研究显示，通过激活PI3K/AKT 通路可以提高神经保护功能，从而抑制氧化应激神经元的自噬[13]。神经源性炎症反应是偏头痛发病的重要病理环节，而抑制NF-κB 和MAPK 通路的激活可减轻神经源性炎症的发生[14-15]。本研究进一步从分子对接的角度阐述蛋白和配体的结合活性，选取了ALB 和IL-6 的两个关键靶点，结果表明，桂芍葛芎汤的主要活性成分与关键疾病靶点均具有良好的对接活性，进一步证实了桂芍葛芎汤的有效成分可通过调控ALB、TNF、IL-6、AKT1 等核心靶点基因，通过上述各富集信号通路发挥治疗偏头痛的作用。

综上所述，本研究通过网络药理学及分子对接的研究方法对桂芍葛芎汤治疗偏头痛的潜在作用机制进行了预测分析，在一定程度上揭示了桂芍葛芎汤可通过多成分、多通路、多靶点防治偏头痛，为桂芍葛芎汤的推广应用提供了理论及基础依据。本研究存在一定的局限性，研究结论仅局限于数据库和相关文献，在今后的临床和实验研究工作中需进一步对筛选的关键靶点及相关通路加以验证。