核桃分心木水提物对肾阳虚大鼠尿17-OHCS、SOD及睾酮的影响

刘鹏 王震 王英 胡本祥

【摘要】  目的  分析核桃分心木水提物对肾阳虚模型大鼠尿17-羟皮质类固醇（尿17-OH-CS）、超氧化物歧化酶（SOD）、睾酮（T）的影响。方法  取40只雄性SD大鼠，根据随机数字表法分为假手术对照组（A组）、肾阳虚模型对照组（B组）、核桃分心木水提物治疗组（C组）及青蛾丸治疗对照组（D组）。采用切除SD大鼠雙侧肾上腺的3/4方法构建肾阳虚模型大鼠。术后4周，C组大鼠灌胃给予核桃分心木水提物，D组大鼠灌胃给予青蛾丸混悬液，A组和B组给予等容量的生理盐水，灌胃4周。观测大鼠一般状态、体温和尿17-OHCS含量、血清SOD、睾酮含量。结果  两两比较结果显示，C组和D组大鼠的体温、尿17-OHCS含量、血清SOD及睾酮含量明显高于B组，但低于A组，差异均有统计学意义（P<0.05）；而各项指标C组低于D组，差异均有统计学意义（P<0.05），表明核桃分心木水提物和青蛾丸均能改善大鼠肾阳虚症状，并且核桃分心木水提物的需要大于核桃分心木水提物。结论  核桃分心木水提物可以有效改善肾阳虚模型大鼠肾阳虚症状。

【关键词】  核桃分心木；水提液；超氧化物歧化酶；睾酮

中图分类号  R285    文献标识码  A    文章编号  1671-0223（2024）01--05

Effects of aqueous extract of walnut distractor on 17-OHCS， SOD and testosterone in rats with kidney yang deficiency Liu Peng， Wang Zhen， Wang Ying， Hu Benxiang. Shangluo Vocational and Technical College， Shangluo 726000， China

【Abstract】    Objective  To analyze the effects of water extract of walnut tree on urinary 17-hydroxycorticosteroids （urinary 17-OH-CS）， superoxide dismutase （SOD） and testosterone （T） in rats with kidney-yang deficiency model. Methods  Forty male SD rats were randomly divided into sham operation control group （group A），kidney yang deficiency model control group （group B），walnut distractor water extract treatment group （Group C） and qingmoth pill treatment control group （Group D）.Three quarters of bilateral adrenal glands of SD rats were excised to construct the model rats of kidney yang deficiency.Four weeks after operation， the rats in group C were given walnut distractor water extract by gavage，the rats in group D were given qingmoth pill suspension by gavage，group A and group B were given equal volume normal saline by gavage for four weeks.The general state， body temperature，urinary 17-OHCS content，serum SOD and T content were observed. Results  The results showed that the body temperature， urinary 17-OHCS content， serum SOD and testosterone contents of rats in group C and group D were significantly higher than those in group B， but lower than those in group A， with statistical significance （P<0.05）. The indexes in group C were lower than those in group D， and the differences were statistically significant （P<0.05）， indicating that both the water extract of walnut and Qingmoth pills could improve the symptoms of kidney-yang deficiency in rats， and the need of water extract of walnut and walnut was greater than that of walnut and walnut. Conclusion  The water extract of walnut distractor can effectively improve the symptom of kidney-yang deficiency model rats.

【Key words】  Walnut distractor; Water extract; Superoxide dismutase; Testosteron

核桃分心木为胡桃科植物胡桃（juglans regia L）果实之间的呈蝴蝶形状的木质间隔，又称核桃隔、胡桃衣。分心木呈薄片状，多弯曲，破碎而不整齐。表面淡棕色至棕褐色，或棕黑色，略有光泽。质脆，易折断，以块大、质薄、色黄为佳。性味苦、涩，平。归脾、肾经。功效：涩精缩尿，止血止带，止泻痢。据《全国中草药汇编》记载，其具有“补肾涩精，主治肾虚遗精、滑精、遗尿”之功效。根据中医理论，肾虚遗精、滑精、遗尿均为肾阳虚之表现。故核桃分心木多与肾阳虚征有着密切的联系[1]。

在我国，核桃种植历史悠久，核桃产业发展迅速。据统计，随着不断增多的核桃深加工产品和不断增长的核桃需求，到2021年核桃在我国市场需求量将达到648.57万吨[2]。核桃分心木作为核桃产业加工的副产品，主要被用作燃料或丢弃，造成巨大浪费，且污染环境。本研究将核桃分心木水提物用于肾阳虚大鼠模型，观察其一般状态、体温和尿17-羟皮质类固醇（17-OHCS）含量，血清中超氧化物歧化酶（SOD）及睾酮（T）的含量，探究核桃分心木水提物的作用效果及作用机制。

1  材料与方法

1.1  实验动物

成年健康SD雄性大鼠40只，体质量200±20g，由西安交通大学动物实验中心提供，动物合格证编号：SCXK（陕）2021-011。将大鼠适应性饲养（大鼠饲养条件：温度控制在20～25℃，湿度控制在40%～70%，标准饲料购于西安交通大学动物实验中心）1周后，根据随机数字表法分为假手术对照组（A组）、肾阳虚模型对照组（B组）、核桃分心木水提物治疗组（C组）及青蛾丸治疗对照组（D组）。

1.2  试剂、药物及设备

核桃分心木，购自陕西商洛。17-羟皮质类固醇（17-OHCS）放免检测试剂盒，上海联祖生物科技有限公司；SOD-ELISA试剂盒，T（睾酮）试剂盒，上海酶联生物科技有限公司；水合氯醛，青岛宇龙海藻有限公司，批号： H37022673；0.9%氯化钠注射液，四川科伦药业股份有限公司，批号： H51021158；5%葡萄糖氯化钠注射液，四川科伦药业股份有限公司，批号： H20043867；甲醇（色谱纯）、三氟乙酸（色谱纯），美国 BCL公司；蒸馏水。

ZH-DXL型大鼠代謝笼，安徽正华生物仪器设备有限公司；GC-1200型自动放免仪，安徽中科中佳科学仪器有限公司；英展TCS-W-300电子秤，江苏昆山托普泰克电子有限公司；MT-601C型电子体温计，杭州广发电子技术有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪厂；SCIENTZ-18N真空冷冻干燥机，山东博科生物产业有限公司；高速离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；美国Waters1525高效液相色谱仪；美国Agilent1290Infinity液相色谱仪；美国Agilent 6540 UHD accurate mass Q-TOF-MS质谱仪，配有电喷雾电离（ESI）离子源，Agilent MassHunter工作站；Agela Venusil XBP-C18色谱柱，Agela科技有限公司；Zorbax  Eclipse  PlusC18色谱柱，Agilent科技有限公司；伯乐T100梯度PCR仪，美国伯乐公司。

1.3  实验方法

1.3.1  核桃分心木水提物的准备  取干燥的核桃分心木，粉碎至100～200目，称量20.0g放置于500ml锥形瓶中，加入400ml蒸馏水，瓶口密封置于阴凉处静置12h，浸提得到核桃分心木水提液。水提液及剩余的粉末均在4℃下冷藏备用。将水提液离心分离（15000r/min），取上清液，上清液经旋转蒸发仪进行浓缩（条件为负压下40℃），将浓缩液经真空冷冻干燥得到分心木水提物干粉。

1.3.2  采用高效液相色谱-串联飞行时间质谱分析核桃分心木水提液化学成分  将上述提取物置于容量瓶中，加水定容，配置成浓度为5mg/ml的溶液，采用0.45μm滤膜过滤。样品溶液在4℃下冷藏备用。利用高效液相色谱-串联飞行时间质谱分析核桃分心木水提液化学成分，具体方法同李平等[3]。

1.3.3  动物造模及给药  取健康SD大鼠40只，经适应性饲养1周。B、C、D组大鼠实验前8小时禁食、禁饮。经10％水合氯醛（0.3ml/100g体重）腹腔注射麻醉后，俯卧，背部剪毛，备皮后采用0.5%碘伏进行局部皮肤消毒。在胸椎及腰椎交界处，沿背部正中线纵向向下切开皮约3cm，先使动物右侧卧位，在左侧肋缘与脊柱交界处，纵行剪开薄层腰大肌，切口约2cm，用血管钳交替分离，以显露大鼠左侧肾脏，切口下肾脏呈深红色。肾脏上方的腹后壁脂肪中呈浅黄色的组织即肾上腺，用蛟式血管钳将周围脂肪组织分离开，用眼科剪刀剪下肾上腺的3/4，给予明胶海绵压迫止血，经检查无出血后间断缝合腰大肌筋膜。再使动物向左侧卧，采用同样方法切除右侧肾上腺的3/4。缝合腰大肌筋膜及背部皮肤，碘伏消毒。A组大鼠除不切除肾上腺外，其它手术过程同B、C、D组。术后连续5d在伤口处涂以红霉素药膏，并每只每天注射20万单位青霉素以预防感染。术后第1天饲养于用刨花作垫料的塑料鼠盒中，室温保持在21～25℃，5%葡萄糖氯化钠注射液代替饮水。术后第2天独笼饲养于大鼠笼内，常规饲料，5%葡萄糖氯化钠注射液代替饮水。继续饲养4周。C组大鼠：给予核桃分心木水提物（高剂量200mg/kg[4]）制成核桃分心木水提物液1ml，每天清晨9∶00灌胃。D组大鼠：给予青蛾丸（80mg/200g·d[5]）制成青蛾丸混悬液1ml，每天清晨灌胃。A组（假手术组）和B组（模型组）大鼠给予等容量的生理盐水灌胃。灌胃4周。

1.4  检测指标

（1）体温：用电子体温计每日清晨8∶00依次测量大鼠体温。

（2）尿17-羟皮质类固醇（尿17-OH-CS）水平：于灌胃4周后清晨8∶00将大鼠依次置于相应标记的代谢笼内至次日清晨8∶00，收集24h尿液，滴加防腐剂0.1ml/10ml防腐，－20℃保存，采用放射免疫法检测尿17-OH-CS含量。

（3）超氧化物歧化酶（SOD）、睾酮（T）含量：于实验最后1天，麻醉大鼠后，心脏快速采血，离心后严格按照SOD-ELISA试剂盒及T试剂盒说明检测大鼠血清中SOD、T的含量。

1.5  数据处理方法

采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析。计量资料以“±s”的形式表示，多组间均数比较采用多因素方差分析，两两比较采用LSD检验；计数资料组间率比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1  核桃分心木水提物化学成分

采用高效液相色谱-串联飞行时间质谱对核桃分心木水提物进行定性分析，结合质谱信息和相关参考文献数据，共计鉴定出4种化合物的结构，分别为没食子酸、儿茶素、槲皮苷和鞣花酸。

2.2  核桃分心木水提物对肾阳虚大鼠模型的影响

实验大鼠在术后2h内苏醒，手术伤口基本不影响大鼠爬行及饮食。术后1周，实验大鼠伤口干燥，伤口皮肤开始愈合；术后2周，实验大鼠伤口皮肤愈合，开始长出新毛，手术组较假手术组大鼠体毛生长缓慢；术后3周，除手术组个别大鼠外，体毛能够均匀覆盖手术切口。术后4周，手术组大鼠出现精神不振、喜蜷卧、反应迟钝、活动减少，体毛稀疏、干枯无光泽，竖毛等表现，提示肾阳虚大鼠模型造模成功。假手术组大鼠一般情况良好，活动较多且反应灵敏，体毛浓密有光泽，大便呈颗粒状。治疗过程中，核桃分心木水提物治疗组及青蛾丸治疗对照组大鼠一般情况均逐渐好转，较模型组反应灵敏，体毛较密、有光泽。

2.3  核桃分心木水提物对大鼠体温和尿17-OHCS含量的影响

灌胃4周后，四组大鼠体温及尿17-OHCS含量比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；其中A组大鼠的体温及尿17-OHCS含量最高，而B组最低。两两比较结果显示，C组和D组大鼠的体温及尿17-OHCS含量明显高于B组，但低于A组，差异均有统计学意义（P<0.05）；而C组低于D组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。表明，核桃分心木水提物和青蛾丸均能改善大鼠腎阳虚症状，但核桃分心木水提物的作用更加突出。

2.4  核桃分心木水提物对大鼠SOD活性影响

灌胃4周后，四组大鼠SOD活性比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；其中A组大鼠的SOD活性最高，而B组最低。两两比较结果显示，C组和D组大鼠的SOD活性高于B组，但低于A组，差异均有统计学意义（P<0.05）；而C组低于D组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表2。表明，核桃分心木水提物和青蛾丸均能提高大鼠SOD活性，但核桃分心木水提物的作用优于青蛾丸。

2.5  核桃分心木水提物对大鼠睾酮含量的影响

灌胃4周后，四组大鼠睾酮含量比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；其中A组大鼠的睾酮含量最高，而B组最低。两两比较结果显示，C组和D组大鼠的睾酮含量高于B组，但低于A组，差异均有统计学意义（P<0.05）；而C组低于D组，差异均有统计学意义（P<0.05），见表3。表明，核桃分心木水提物和青蛾丸均能提高大鼠睾酮含量，但核桃分心木水提物的作用优于青蛾丸。

3  讨论

肾阳虚证为中医名词术语，是由于肾阳虚衰、温煦失职、气化失权所表现的一类虚寒证候，称为肾阳虚证。多由素体阳虚，或年老肾亏，或久病伤肾，以及房劳过度等因素引起。肾阳虚证属于中医理论体系中的重要证候之一，临床表现多样，如神疲乏力、畏寒怕冷、四肢发凉、腰膝酸痛、性功能减退、小便清长、余沥不尽、夜尿频多等。中医提出肾阳虚证发生的命门学说，即肾为先天之本，肾中寓真阴真阳，肾阳主一身之阳气，命门火衰则阳虚之证迭出。阳虚证为诸多病症的根源所在，因此一直备受医学界关注[6]。有研究证明，肾阳虚证与神经内分泌功能关系密切。沈自尹[7]采用中西医结合的方法治疗肾阳虚证时，发现患者24h尿17-OHCS含量普遍低下，经补肾后其值有所提高。并有研究发现肾阳虚与现代医学的神经内分泌免疫系统有关，肾阳虚证在下丘脑-垂体-靶腺（肾上腺皮质、甲状腺、性腺、胸腺）轴均有不同环节、不同程度的功能紊乱，且主要发病环节在下丘脑（或更高级中枢）的调节功能紊乱。这也是目前认为造成肾阳虚证的主要病机。中医认为阳气有温煦机体的功能，肾阳为一身阳气之根本。肾阳虚，则温煦功能减弱，机体产热减少，表现为怕冷，喜蜷卧，客观指标上则体温偏低。尿17-OHCS是反映下丘脑-垂体-肾上腺轴功能的客观指标，是沈氏等经过临床实践和深入基层进行一定数量调查后所得出的结论[8]，是肾阳虚证的特异性指标。

SOD又称超氧化物歧化酶，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质，其具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质。对人体不断地补充SOD具有抗衰老的效果。SOD在生物体内的水平高低意味着衰老与死亡的直观指标。睾酮主要由睾丸分泌，是主要的男性性激素及同化激素，对人体健康有重要的影响，主要包括增强性欲、力量、免疫功能、对抗骨质疏松症等功效。哺乳动物和人在代谢过程中睾丸中可生成一定程度受控的自由基，它与精子的生理功能有关，当自由基的产生超出了抗氧化系统的清除能力时，则会攻击精子，对精子及生物大分子产生各种毒性作用，影响睾丸的生精功能[9]。男性的睾丸受氧化损伤时常伴随有肾阳虚症状[10]。同时睾酮缺乏是男性肾阳虚发生的重要原因[11]。本实验证实，肾阳虚大鼠SOD活性降低，睾酮含量下降。而在应用核桃分心木水提物灌胃后，SOD活性增强，睾酮含量升高。提示核桃分心木水提物可以有效对抗氧化损伤，有效改善肾阳虚症状。

本实验采用高效液相色谱-串联飞行时间质谱对核桃分心木提取液进行定性分析，结合质谱信息，以及相关参考文献数据，共计鉴定出4种化合物的结构，分别为没食子酸、儿茶素、槲皮苷和鞣花酸，结果与文献报道相一致[3]。其中没食子酸（化学名称：3，4，5-三羟基苯甲酸，分子式：C7H6O5）是一种多酚类有机化合物，广泛存在于大叶桉、掌叶大黄、山茱萸等植物中，在食品、生物、医药、化工等领域有广泛的应用。没食子酸是天然多酚类物质，具有抗突变、抗炎、抗病毒、抗自由基、抗氧化等多种生物学活性；同时没食子酸具有抗肿瘤作用，小剂量没食子酸抑制ras癌基因信号活化和免疫调节的作用，但其抗肿瘤作用具体机制不明[12]；对肝脏具有保护作用，可以抵抗四氯化碳诱导的肝脏生理和生化的转变，可通过抑制内皮NO的生成诱导血管内皮依赖性收缩和对内皮依赖性松弛 [13]。儿茶素（分子式：C15H14O6）系从茶叶等天然植物中提取出来的一类具有高活性的类黄酮的总称，具有抗氧化、抗病菌、抗肿瘤以及保护心脑器官等多种药理作用。儿茶素可降低血中胆固醇及低密度脂蛋白，并增加高密度脂蛋白的含量，对人体脂肪代谢以及脂肪分布，特别是内脏脂肪的减少有着明显的作用。儿茶素可以改变肠道微生物的分布，具有整肠作用。儿茶素还具有抑制血压及血糖、抗辐射及抗突变、抗紫外线等功用[14]。槲皮苷是一种广泛存在于植物中的黄酮类单体化合物，具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖、降血脂等多种药理作用。槲皮苷具有一定的抗炎活性，主要表现为致炎性因子的抑制作用。槲皮苷对中枢神经系统有抑制作用，具有镇静催眠作用。此外，槲皮苷还有止血、防治基因突变性疾病的作用[15]。鞣花酸是广泛存在于各种软果、坚果等植物組织中的一种天然多酚组分，鞣花酸对化学物质诱导癌变及其他多种癌变有明显的抑制作用，特别是对结肠癌、肺癌、肝癌、食管癌、舌及皮肤肿瘤等有很好的抑制作用。鞣花酸具有多种生物活性功能，例如抗氧化功能、抗癌、抗突变性能、对人体免疫缺陷病毒的抑制作用。除此之外，鞣花酸还是一种有效的凝血剂，对多种细菌、病毒都有很好地抑制作用，能保护创面免受细菌的侵入，防止感染，抑制溃疡。同时经研究发现，鞣花酸还具有降压、镇静作用。通过本次对核桃分心木提取液的化学分析，也与文献报道核桃分心木具有镇静催眠、降血糖、抗炎、抗菌、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤等作用相一致。

本实验证实核桃分心木提取液及青蛾丸均可明显改善肾阳虚模型大鼠的体表温度，尿中排出17-OH-CS增多，SOD活性增强，睾酮含量升高，提示肾阳虚症状明显改善，这与核桃分心木提取液中的没食子酸、儿茶素、槲皮苷和鞣花酸等成分密切相关。这些成分可以缓解下丘脑-垂体-靶腺功能的紊乱，达到调节神经内分泌作用，抗氧化损伤，同时发挥增强免疫功能、防止蛋白质代谢紊乱、防基因突变、促进能量及细胞代谢作用，最终达到全面缓解肾阳虚症状，促进痊愈。

通过实验研究证明， 核桃分心木提取液可以明显改善肾阳虚模型大鼠症状。这为下一步将核桃分心木用于肾阳虚患者及亚健康人群的保健茶饮，提供了一定的实验依据。

4  参考文献

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[2023-04-17收稿]