基于网络药理学和分子对接探讨壮骨强筋片治疗老年性骨质疏松症的作用机制

邬裕 ，周泽霖 ，欧阳帅 ，陈松海 ，叶林强 ，张志刚 ，王志强 ，卢国樑

1.广州中医药大学东莞医院，广东 东莞 523000；2.广州中医药大学第一临床医学院，广东 广州 510405

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是一种以骨骼脆性增加、骨微结构破坏为特征的全身性疾病[1]，其中老年性骨质疏松（senile osteoporosis，SOP）多发于70岁以上人群[2]，随着人口老龄化社会的到来，SOP患病率呈逐年上升趋势[3]。目前临床多应用钙剂、双磷酸盐类、抗骨吸收剂等药物防治SOP，但由于较高的医疗费用和不良反应限制了其长期应用[4-5]。中医药治疗OP疗效显著，且不良反应较少，适合长期应用，可为SOP的防治提供思路。

壮骨强筋片是由广州中医药大学东莞医院叶伟洪教授团队研发的院内中药复方制剂，已广泛用于各类骨伤疾病的临床治疗，具有维持骨量、提升骨密度的作用，临床疗效较好[6-9]。研究表明，壮骨强筋片可促进老年模型大鼠骨髓基质干细胞增殖与成骨分化[10]，但其作用机制尚未明确。因此，探索壮骨强筋片潜在的药物活性成分和相关作用靶点，分析其作用机制，对于阐述壮骨强筋片临床应用的科学性有重要意义。本研究基于网络药理学和分子对接技术，分析壮骨强筋片治疗SOP的活性成分、相关靶点与信号通路，探讨其治疗SOP的作用机制。

1 资料与方法

1.1 药物活性成分及靶点获取

检索TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）中壮骨强筋片组方药物杜仲、千斤拔、淫羊藿、肉苁蓉、牛膝、党参、当归、地骨皮、羌活、独活的化学成分，并获取其靶点。以口服生物利用度（OB）≥30%、类药性（DL）≥0.18为条件，筛选活性成分。通过UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）查询并转换为靶点对应的人类基因名。

五加皮、鹿角胶、何首乌、龟甲未收录于TCMSP，故利用中药高通量实验和参考数据库（HERB，http://herb.ac.cn/）[11]查找其化学成分，以OB≥30%、DL≥0.18为条件筛选活性成分。由于HERB数据库中龟甲无符合条件的成分，通过PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获得龟甲化学成分的SMILE号，再通过SwissTargetPrediction数据库（http://new.swisstargetprediction.ch/），设置物种为“Homo Sapiens”、Probability＞0，筛选龟甲活性成分。利用UniProt数据库中的UniprotKB对靶点名称进行规范化处理，得到龟甲活性成分作用靶点。

1.2 筛选疾病药物交集靶点

以“Senile Osteoporosis”为关键词，检索DisGeNet数据库（www.disgenet.org）、GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）和OMIM数据库（https://www.omim.org）中SOP相关靶点，其中，DisGeNet数据库设置score≥0.3，GeneCards数据库设置score≥5，删除重复项，获得SOP相关靶点。利用R4.2.0中的VennDiagram包，将SOP靶点与壮骨强筋片药物活性成分靶点进行映射，得到交集靶点。

1.3 “疾病-药物-成分-交集靶点”网络构建

将交集靶点及其对应的药物成分、靶点基因数据导入Cytoscape3.8.0，采用Network功能构建“疾病-药物-成分-交集靶点”网络，并进行网络特征分析，以度值排名前10位的活性成分为核心成分。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用网络构建

将交集靶点导入STRING数据库（https://stringdb.org/），隐藏孤立蛋白靶点后获得蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）数据，导入Cytoscape3.8.0中构建PPI网络，利用CytoNCA插件进行网络拓扑分析，以节点度值前10位的靶点作为核心靶点。

1.5 生物信息学分析

将交集靶点导入DAVID数据库（http://david.ncifcrf.gov/），限制物种条件为“Homo Sapiens”，设定阈值为P＜0.05，对交集靶点进行GO功能与KEGG通路富集分析，采用R4.2.0中的“ggplot”程序包，设置P-value与Q-value的Cutoff值为0.05，将GO生物过程、细胞组分、分子功能及KEGG信号通路中显著性前10位的富集结果进行可视化展示。将KEGG信号通路富集结果CSV数据导入Cytoscape3.8.0，构建“核心靶点-信号通路”网络。

1.6 分子对接

选取“疾病-药物-成分-交集靶点”网络中度值排名靠前的核心成分与PPI网络中度值排名靠前的核心靶点蛋白进行分子对接验证。分别从RSCB PDB数据库（https://www.rcsb.org/）获取靶点蛋白的晶体结构文件，从PubChem数据库获取核心成分的结构文件，使用AutoDockTools软件计算核心成分与靶点蛋白间的最低结合能，并将分子对接模式进行可视化。

2 结果

2.1 壮骨强筋片活性成分及作用靶点

检索TCMSP和HERB数据库，获得壮骨强筋片组方药物杜仲28个、羌活15个、独活9个、地骨皮13个、千斤拔1个、五加皮4个、淫羊藿23个、鹿角胶2个、肉苁蓉5个、牛膝15个、何首乌8个、党参15个、当归2个活性成分。通过检索SwissTargetPrediction数据库，得到龟甲活性成分15个。获得壮骨强筋片活性成分作用靶点270个。

2.2 壮骨强筋片治疗老年性骨质疏松潜在靶点预测

检索DisGeNet、GeneCards、OMIM数据库，分别获得73、1 133、45个靶点，去重后得到433个SOP相关靶点。将疾病靶点与药物靶点相映射，得到61个交集靶点。

2.3 “疾病-药物-成分-交集靶点”网络分析

将中药、活性成分、疾病及交集靶点导入Cytoscape3.8.0，构建“疾病-药物-成分-交集靶点”网络，见图1。该网络包括171个节点和509条边，节点之间的连线表示疾病-交集靶点、药物-成分、成分-交集靶点具有相互关系。

图1 壮骨强筋片治疗SOP“疾病-药物-成分-交集靶点”网络

根据度值排序，以前10位的活性成分为核心成分，包括槲皮素、木犀草素、山柰酚、汉黄芩素、黄芩素等，见表1。

表1 壮骨强筋片治疗SOP核心成分

2.4 蛋白质-蛋白质相互作用网络分析

将交集靶点导入STRING数据库，获得PPI关系信息，导入Cytoscape3.8.0构建PPI网络，见图2。网络包括60个节点、349条边。网络中节点颜色深浅代表度值大小，颜色越深度值越大，颜色越浅度值越小。度值排名前10位的靶点蛋白分别为TNF（度值32）、IL6（度值29）、AKT1（度值27）、VEGFA（度值25）、TP53（度值24）、IL1B（度值24）、MMP9（度值23）、IL10（度值21）、CCL2（度值20）、CTNNB1（度值20），可能为壮骨强筋片治疗SOP的核心靶点。

图2 壮骨强筋片治疗SOP靶点PPI网络

2.5 GO功能富集分析

使用R4.2.0对61个交集靶点进行GO功能富集分析，得到生物过程1 717个条目，细胞组分22个条目、分子功能84个条目。其中生物过程主要富集于氧化应激反应、生殖结构发育、生殖系统发育、凋亡信号通路的调控、细胞对脂多糖的反应、平滑肌细胞增殖的调控、平滑肌细胞增殖等方面。细胞组分主要涉及转录调节器复合体、胞质囊腔、细胞膜筏、囊腔、膜微域等部位。分子功能主要涉及信号受体激活物活性、受体配体活性、细胞因子活性、细胞因子受体结合程度、转录辅助调节因子结合、生长因子受体结合程度等方面，见图3～图5。

图3 壮骨强筋片治疗SOP靶点GO生物过程富集分析气泡图

图4 壮骨强筋片治疗SOP靶点GO细胞组分富集分析气泡图

图5 壮骨强筋片治疗SOP靶点GO分子功能富集分析气泡图

2.6 KEGG通路富集分析

使用R4.2.0对61个交集靶点进行KEGG通路富集分析，得到123条通路，包括AGE-RAGE信号通路、脂质和动脉粥样硬化、流体剪切应力和动脉粥样硬化等，见图6。运用Cytoscape3.8.0构建“核心靶点-信号通路”网络，见图7。

图6 壮骨强筋片治疗SOP靶点KEGG通路富集分析气泡图

图7 壮骨强筋片治疗SOP“核心靶点-信号通路”网络

2.7 分子对接验证

将“疾病-药物-成分-交集靶点”网络中度值前5位的核心成分（槲皮素、木犀草素、山柰酚、汉黄芩素、黄芩素）与PPI网络中度值排名前6位的靶点（TNF、AKT1、TP53、IL6、VEGTA、MMP9）进行分子对接，得到核心成分与靶点蛋白间的结合能结果，见图8。图中纵坐标代表靶点蛋白，横坐标为壮骨强筋片的核心成分，颜色越深红代表结合能越高。结果显示，大部分核心成分和靶点均有较优的对接活性（Total Score≤-5.0 kcal/mol），表明壮骨强筋片核心成分与靶点结合作用良好。将具有最低结合能的4对配体和受体分子对接模式进行可视化处理，见图9。

图8 壮骨强筋片治疗SOP核心成分与靶点分子对接结合能热图

图9 壮骨强筋片治疗SOP核心成分与靶点分子对接构象图

3 讨论

SOP属中医学“骨枯”“骨痿”等范畴。《黄帝内经》提到“骨痿”其标在骨，其本在肾，因此“骨痿者，补肾法治之”正是治病求本的体现。壮骨强筋片方中杜仲、五加皮、淫羊藿、肉苁蓉、鹿角胶、千斤拔、牛膝等补肾阳，强筋骨；羌活、独活祛风湿，止痹痛；党参、当归补脾肺，养气血；龟甲、何首乌、黄柏、地骨皮滋肾阴，除骨蒸。全方共奏滋补肝肾、强筋壮骨、益气养血之效。

本研究基于网络药理学和分子对接技术分析了壮骨强筋片治疗SOP的活性成分、潜在作用靶点与作用通路，结果显示，壮骨强筋片治疗SOP的核心成分为槲皮素、木犀草素、山柰酚等。研究发现，槲皮素可促进骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化，进而对骨损伤具有保护作用[12]；木犀草素可减轻氧化应激，促进成骨细胞分化，从而促进细胞增殖，减轻糖皮质激素诱导的OP[13]；山柰酚可通过抑制脂肪生成、炎症、氧化应激、破骨细胞自噬和成骨细胞凋亡，达到骨保护作用[14]。因此，壮骨强筋片可能主要通过槲皮素、木犀草素、山柰酚等活性成分发挥治疗SOP作用。

通过靶点预测得到61个交集靶点，PPI网络分析结果表明，壮骨强筋片作用于SOP的核心靶点包括TNF、IL6、AKT1、VEGFA等。其中，TNF度值排序第一，可能是壮骨强筋片治疗SOP的关键靶点。TNF为促炎性细胞因子，主要由巨噬细胞分泌，可参与调控多种生物过程，如细胞增殖、分化、凋亡等。研究发现，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）可直接增强骨细胞中核因子κB受体活化因子配体（RANKL）表达，促进破骨细胞形成[15]。同时，机械力可诱导TNF-α，使其表达骨硬化蛋白，进而引起破骨细胞形成[16]。此外，TNF-α可通过独立于RANKL的其他信号通路介导破骨细胞的形成，进而导致骨吸收[16-17]。在成骨方面，TNF-α可通过核因子κB（NF-κB）通路靶向Runx2基因，抑制成骨细胞分化[17]。因此，推测TNF上调是SOP发生的重要因素，壮骨强筋片可能通过下调TNF治疗SOP。度值排名第二的靶点为IL6，也是一种促炎性细胞因子，具有调节免疫系统的作用。白细胞介素（IL）-6可间接通过RANKL促进破骨细胞生成，并增强骨吸收，与TNF-α具有共同增强成骨细胞自噬的作用，TNF-α在TNFR1的调控下通过各种信号通路介导细胞自噬，IL-6在此过程中扮演重要角色[18]。AKT1是AKT家族成员，可被PI3K活化后发挥作用，并可调节细胞增殖、代谢及血管生成等过程。AKT1是成骨细胞的负向调控因子，其下调可促进成骨细胞生成，并可降低破骨细胞特异性的mRNA，减少破骨细胞生成[19]。VEGFA是血管内皮生长因子（VEGF）家族成员，成骨细胞源性VEGF可调控成骨细胞分化，并且VEGF也调控成脂分化与成骨分化之间的平衡，这种平衡的破坏是发生OP的潜在机制[20]。由“疾病-药物-成分-交集靶点”网络可见，壮骨强筋片治疗SOP是通过多靶点、多途径较为复杂的机制下实现。

GO功能富集分析结果显示，主要的生物过程包括氧化应激反应、生殖结构发育、生殖系统发育、调节自噬相关的信号通路等。其中氧化应激反应和自噬相关信号通路与免疫应答密切相关，因此其过程会受到TNF-α、IL-6等炎症因子的调控，进而推进OP的病理过程。另外，壮骨强筋片治疗SOP的相关靶作用点可富集于生殖发育相关的生物过程。雌激素、雄激素等性激素的调控可直接或间接地导致SOP[21]，这也与中医学中“肾藏先天之精”“精生髓”“髓生骨”等理论对应。

KEGG通路富集结果显示，与糖尿病并发症相关的AGE-RAGE信号通路、脂质和动脉粥样硬化、流体剪切应力和动脉粥样硬化、炎症反应和细胞的糖脂代谢有紧密联系，故与GO功能富集结果和PPI网络分析的规律相同。长期持续性的高糖高脂状态可破坏骨质的细微结构、矿物沉积及骨的生物力学强度[22-23]。晚期糖基化终末产物（AGEs）主要来源于高糖血症，并可驱使氧化应激反应及异常骨重建[24]。AGEs上调可促进活性氧产生，并通过AGEs受体（RAGE）激活，导致NF-κB染色体移位并继发促进组织蛋白酶K表达，最终导致骨吸收[25-26]。壮骨强筋片可能通过清除AGEs方式降低氧化应激反应，进而减少骨吸收，达到治疗SOP的目的。根据KEGG富集结果可见，信号通路排序二、三的通路均与动脉粥样硬化相关，动脉粥样硬化常继发于糖尿病之后，且与骨量减少具有相关性[27]。不同程度下的炎症状态均会引发OP与动脉粥样硬化，因此TNF-α、IL-6、IL-17等炎症因子对动脉粥样硬化与OP的发病具有共同的作用[28]。此外，脂肪分泌因子如脂联素、瘦素、抵抗素和趋化素亦与动脉粥样硬化和OP具有相关性[29]。因此，从核心信号通路可推测壮骨强筋片是通过调节免疫与糖脂代谢方式治疗SOP。

综上，壮骨强筋片治疗SOP主要通过槲皮素、木犀草素、山柰酚等活性成分，作用于TNF、IL6、AKT1、VEGFA等关键靶点，进而通过调控免疫与细胞代谢治疗SOP，表明壮骨强筋片发挥多成分、多靶点、多网络的药理作用。本研究结果可为既往壮骨强筋片的临床疗效提供分子层面的支撑，亦为后续相关药理机制研究和实验提供数据支持。