微生物菌剂与大蒜油配施对银叶病苹果叶片生理特性及果实品质的影响

陈 悦, 张秀英, 张 丹, 邓代清, 李玉涵, 程安富, 黄先敏, 马仲炼, 杨德粉, 全 勇*

(1.昭通学院,云南 昭通 657000;2.昭通市苹果产业发展中心,云南 昭通 657000)

苹果银叶病报道始见于20世纪50年代,是一种能导致苹果等果树快速死亡的毁灭性病害,不仅危害苹果,也危害梨、桃、李等果树[1]。此病在我国大部分果区都有发生。从2008年开始,在云南昭通银叶病逐渐成为了影响苹果生产的主要病害。该病害由真菌引起,病原微生物为Stereumpurpureum(Pers.)Fr.,属担子菌亚门韧革菌属[2]。病原菌在果树茎干和根的木质部、髓部产生大量的毒素,毒素随着树体内的物质运输传至整株果树,对果树造成严重的伤害,甚至导致其死亡。苹果树染病后,首先是木质部变为褐色,有腥味,随着毒素的传播,果树叶片也开始出现症状,表现为变黄变脆,叶片的上表皮和叶肉中的栅栏组织之间分离,并充满了空气,使得叶片在阳光照射下呈现银白色[3]。发病较轻的果树树势衰弱,发芽迟缓,叶片较小,结果能力逐渐降低;重病树根系逐渐腐烂死亡,最后整株枯死。病树枯死后,在枝干表面可产生边缘卷曲的覆瓦状淡紫色病菌结构[4]。掌握防治此病害的有效办法对建立健康果园具有重要意义。

前人对苹果银叶病的研究多集中在防治技术上,如利用打孔注药、树盘灌根治疗[5],不同药剂不同方式防治效果不尽相同[6-9]。但对苹果银叶病生理症状逆转缓解方面报道较少,Grinbergs D等[10]研究比较健康植物、感病植物和恢复植物的生理、内生微生物群落、内生植物对抗性等方面的差异和防御基因表达,证明银叶病症状的逆转与内生微生物群的变化有关。叶片是进行光合作用的重要器官、果实品质是光合作用产物累积的间接表现,本研究以患银叶病苹果树为材料,采用微生物菌剂与大蒜油配施对患病树叶片生理特性及果实品质变化进行研究,通过观察叶片解剖学特征,测定叶片生理生化物质和果实品质指标,探究微生物菌剂与大蒜油配施对患病叶片生理特性逆转和果实品质的影响,为本病的防治提供理论依据。

1 试验材料与方法

1.1 地点及材料

试验于2020—2021年进行,地点位于昭通市昭阳区永丰镇(103.6oE,27.23oN),平均海拔在2 000 m。年平均气温 11.8 ℃,≥10 ℃的年平均活动积温3 723.7 ℃,年平均降水量 699.6 mm,日照时数1 843.4 h,无霜期221 d[11]。经云南三标农林科技有限公司检验,供试果园内的土壤基本数据为:pH值5.2,有机质含量19.6 g/kg,水解性氮(N)含量97 mg/kg,有效磷(P)含量94.9 mg/kg,速效钾(K)含量428 mg/kg。供试果树为患银叶病红富士苹果树,株行距3 m×4 m,行向为东西朝向。

1.2 供试肥料

大蒜油:漯河鑫禾生物科技有限公司生产。

微生物菌剂(果根保):刘氏果业集团公司生产,25 kg/袋。主要成分为巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌,增效成分(矿物有机菌):钾≥5.0 g/kg,锌≥0.20 g/kg,硼≥0.50 g/kg,钼≥0.20 g/kg,钙≥30.0 g/kg,镁≥20.0 g/kg,硫≥30.0 g/kg,氮≥3.0 g/kg,磷≥6.0 g/kg,有机质≥20.0 g/kg,活性菌0.20亿/g;微量及有益元素(锰+铜+硅+镍+锶+硒+钛+锂+锗+碘+铝+钴+钡+钇+钐+钕+铕+钬+铒+铥+镨+钪+镧)68.0 g/kg。

1.3 试验处理

选取患有银叶病苹果树18株,每3株作为一个处理小区,另选3株未患病苹果树作为对照,共设7个处理。处理如下:CK:健康树+清水;L1:患病树+清水;L2:患病树+微生物菌剂2.5 kg/株;L3:患病树+微生物菌剂2.5 kg /株+大蒜油50 mL/株;L4:患病树+微生物菌剂2.5 kg/株+大蒜油150 mL/株;L5:患病树+微生物菌剂2.5 kg/株+大蒜油250 mL/棵;L6:患病树+微生物菌剂2.5 kg/株+大蒜油350 mL/株。

连续处理2年,于2020年3月25日和2021年的3月25日、6月25日,在苹果园地面上顺着果树根系挖6条呈放射状分布的支沟,沟深20 cm,沟长130 cm,沟宽25 cm,将大蒜油(大蒜油使用前需进行稀释处理,配制成有效成分为0.05%、0.15%、0.25%、0.35%的大蒜油,即50 mL、150 mL、250 mL、350 mL的大蒜油加入清水定容到100 L[12],每一支沟约施入33.33 L油水混合物)和微生物菌剂交替施入每一条支沟。施肥、除草、修剪、病虫害防治及疏花疏果等田间管理措施与当地果农保持一致。

1.4 试验方法

每个指标测定重复3次。

1.4.1 叶片生理指标测定

2021年8月选取1年生枝条上从基部数第8～9片,避开主脉和叶片边缘部位进行测定。1年生苹果枝条叶片颜色通过表观对比;叶片解剖结构做徒手切片并用CX40M生物显微镜观察;采用YMJ-A叶面积仪测定苹果叶片叶型的基本数据,包括叶面积、叶周长、大叶宽、大叶长、长宽比。采用手持式叶绿素测定仪测定叶片中叶绿素含量。参照蔡永萍[13]的测定方法,用考马斯亮蓝法测定叶片中可溶性糖质量分数,蒽酮比色法测定叶片中可溶性蛋白含量,硫代巴比妥酸法测定叶片中丙二醛含量。

1.4.2 苹果品质的测定

取样时间为2021年10月苹果成熟期,取样时在树冠中上部沿东、南、西、北4个方向随机摘取1个苹果,每株果树摘4个苹果,每个处理共摘12个苹果进行品质测定。采集的样品保存于4 ℃冰箱,在1周内完成测量,求其平均值作为最终的测定结果。参照曹建康[14]的试验方法,采用硬度计测定苹果果实硬度、2,6-二氯酚靛酚滴定法测定果实中抗坏血酸含量、手持式糖度计测定可溶性固形物质量分数、氢氧化钠溶液滴定法测定果实中可滴定酸质量分数、蒽酮试剂法测定苹果中可溶性糖质量分数。

1.5 数据分析

利用WPS Excel 2016统计软件、SPSS程序软件(IBM SPSS statistics 26)进行数据计算与统计分析,P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同处理1年生苹果枝条叶片表观对比分析

与CK对比,处理L1、L2表现1年生枝条叶片均呈银灰色,处理L3和L4叶片逐渐变绿状态有所缓解,L5和L6缓解效果较好,叶片翠绿色富有光泽。

由图1可以看出,正常叶上表皮细胞致密排列,病叶上表皮细胞疏松排列,栅栏组织和叶肉细胞不通透,难以看到细胞之间的界限,可能与苹果银叶病的病原菌在果树茎干和根的木质部、髓部产生大量的毒素运输至叶片有关。与CK相比,用微生物菌剂和大蒜油处理后,L1、L2栅栏组织和叶肉细胞不通透,难以看到细胞之间的界限;L3和L4可看清栅栏组织和叶肉细胞间间隙;L5和L6可看清栅栏组织和叶肉细胞间间隙,表皮细胞致密排列,叶肉细胞通透清晰,呈绿色。

图1 苹果叶片纵切面(200x)

2.2 苹果叶片生理指标

2.2.1 不同处理的苹果叶片叶型差异分析

1)叶面积。由表1可知,处理L6(56.250 cm2)叶面积与CK(58.633 cm2)之间差异不显著,二者均显著高于处理L1(41.128 cm2)、L2(40.394 cm2)、L3(43.598 cm2)、L4(48.880 cm2)、L5(56.144 cm2);处理L4、L5叶面积显著高于处理L1、L2;处理L1、L2、L3、L4、L5叶片叶面积比CK叶片叶面积分别减少29.86%、31.11%、25.64%、16.63%、4.25%,差异达显著水平。由此可见,苹果树感染银叶病后叶面积减少,通过微生物菌剂与大蒜油配施可使叶片叶面积增加,以L6处理恢复效果最好。

表1 不同处理苹果叶片差异

2)叶周长。由表1可知,处理L5叶周长(34.580 cm)与CK(35.173 cm)差异不显著,显著高于其他处理;处理L1(26.695 cm)、L2(24.960 cm)、L3(28.416 cm)、L4(28.808 cm)、L6(31.036 cm)均显著低于CK,分别减少24.10%、29.04%、19.21%、18.10%、11.76%;处理L6显著高于处理L1、L2。由此可见,苹果树感染银叶病后叶周长减少,通过微生物菌剂与大蒜油配施可使叶周长增加,以L5处理恢复效果最好。

3)大叶长。由表1可知,处理L5(12.170 cm)、L6(10.708 cm)大叶长与CK(10.670 cm)差异不显著,显著高于处理L1(8.804 cm)、L2(9.292 cm)、L3(9.488 cm);处理L5显著高于除L6之外其他处理;且所有处理均显著高于处理L1,处理L1叶片大叶长比CK减少17.49%,差异显著。由此可见,苹果树感染银叶病后大叶长减少,通过微生物菌剂与大蒜油配施可使大叶长增加,以L5处理效果最好。

4)大叶宽。由表1可知,处理L5(7.634 cm)、L6(7.748 cm)大叶宽显著高于处理L1(6.178 cm)、L2(6.230 cm)、L3(6.814 cm);处理L1叶片大叶宽比CK减少31.51%,差异显著。由此可见,苹果树感染银叶病后大叶长减少,通过微生物菌剂与大蒜油配施可使大叶长增加,以L5、L6处理效果最好。

综合表1可知,苹果树感染银叶病后叶片叶面积、叶周长、大叶长和大叶宽均显著减少,通过微生物菌剂与大蒜油配施后使叶面积、叶周长、大叶长和大叶宽均增加。

2.2.2 不同处理的苹果叶片生理特性特征差异分析

叶绿素:植物体内的叶绿素参与光合作用。由表2可知,CK叶绿素含量(54.971)显著高于处理L1(46.572)、L2(48.786)、L3(49.786)、L4(50.153)、L5(52.356)、L6(52.811),分别高出15.28%、11.25%、9.43%、8.76%、4.76%、3.93%;处理L5、L6叶绿素含量显著高于其他处理,提高4.21%%～11.81%。由此可见,苹果树感染银叶病后叶绿素含量降低,通过微生物菌剂与大蒜油配施可提高叶片叶绿素的含量,以L6处理效果最好。

表2 不同处理的苹果叶片生理特性特征差异

可溶性蛋白:植物体内的可溶性蛋白质大部分是参与各种代谢的酶类。由表2可知,处理L1(9.783 mg/g)、L2(10.480 mg/g)叶片可溶性蛋白含量显著低于CK(12.443 mg/g),分别降低21.38%、15.78%;处理L4(13.040 mg/g)、L5(13.947 mg/g)、L6(13.280 mg/g)可溶性蛋白含量显著高于处理L1、L2;处理L5显著高于CK,可溶性蛋白含量提高了10.78%。处理L2和L1之间无显著差异,处理L3、L4、L5、L6和L1之间差异显著,提高7.12%～29.86%。由此可见,苹果树感染银叶病后可溶性蛋白质含量降低,通过微生物菌剂与大蒜油配施可提高叶片蛋白质含量,以L5处理效果最好。

可溶性糖:糖类物质提供了合成抗逆物质的碳源。由表2可知,CK叶片可溶性糖质量分数(5.465%)显著高于其他处理,苹果树患银叶病后叶片可溶性糖质量分数降低14.78%～23.77%;施用微生物菌剂与大蒜油后,叶片中可溶性糖质量分数有多提高,处理L5(4.657%)显著高于L1(4.166%),提高11.79%;其余处理之间无显著性差异。由此可见,苹果树感染银叶病后可溶性糖质量分数降低,通过微生物菌剂与大蒜油配施可提高叶片可溶性糖质量分数,以L5处理效果最好。

丙二醛:丙二醛含量的高低直接反映出植物受到胁迫的程度高低,丙二醛含量越高说明植物的受伤程度越严重。由表2可知,处理L1丙二醛含量(68.057 nmol/g)显著高于CK(21.740 nmol/g),提高213.05%;施用微生物菌剂与大蒜油后,丙二醛含量显著降低,降低范围在25.31%～46.36%;处理L5(36.933 nmol/g)、L6(36.507 nmol/g)丙二醛含量显著低于其他处理,但两者之间差异不显著。由此可见,苹果树感染银叶病后丙二醛含量上升,通过微生物菌剂与大蒜油配施可降低丙二醛含量,以L5、L6处理效果较好。

综合表2可知,苹果树感染银叶病后叶片叶绿素、可溶性蛋白质和可溶性糖质量分数均显著降低,丙二醛含量升高。通过微生物菌剂与大蒜油配施后叶片叶绿素、可溶性蛋白质和可溶性糖质量分数均显著增加,丙二醛含量显著降低,且处理L5效果最好。

2.3 不同处理的苹果果实品质分析

硬度:由表3可知,处理L1果实硬度(8.323 kg/cm2)比CK果实硬度(12.827 kg/cm2)降低35.11%,差异显著;处理L2(9.913 kg/cm2)、L3(10.157 kg/cm2)、L4(11.200 kg/cm2)、L5(11.720 kg/cm2)、L6(11.093 kg/cm2)与CK果实硬度之间差异显著,降低8.63%～22.72%,其中L5果实硬度降低最少,降低8.63%。处理L2、L3、L4、L5、L6和L1之间差异显著,果实硬度大小为L5>L4>L6>L3>L2>L1。由此可见,苹果树感染银叶病后果实硬度降低,通过微生物菌剂与大蒜油配施可提高果实硬度,以L5处理效果最好。

表3 不同处理的苹果果实品质的比较

可溶性固形物:由表3可知,处理L1果实可溶性固形物质量分数(16.400%)比CK(18.600%)降低11.83%,差异显著;处理L2(16.968%)、L3(16.400%)、L4(17.467)、L6(17.800%)与CK果实可溶性固形物之间差异显著,降低3.05%～11.83%;L5与CK果实可溶性固形物之间差异不显著,仅降低3.05%;处理L4、L5、L6和其他处理之间差异显著;其他处理间差异不显著。由此可见,苹果树感染银叶病后果实可溶性固形物质量分数降低,通过微生物菌剂与大蒜油配施可提高果实可溶性固形物质量分数,以L5处理效果最好。

抗坏血酸:由表3可知,处理L1果实抗坏血酸含量(7.292 mg/100 g)比CK(12.293 mg/100 g)降低40.64%,差异显著;处理L2(7.353 mg/100 g)、L3(8.403 mg/100 g)、L4(9.627 mg/100 g)、L5(10.863 mg/100 g)、L6(10.740 mg/100 g)与CK果实抗坏血酸之间差异显著,降低11.63%～40.10%;L5与CK果实抗坏血酸之间差异最小,降低11.63%。由此可见,苹果树感染银叶病后果实抗坏血酸含量降低,通过微生物菌剂与大蒜油配施可提高果实抗坏血酸含量。

可滴定酸:由表3可知,处理L1果实可滴定酸质量分数(0.396%)比CK(0.238%)增加66.39%,差异显著;处理L2、L3、L4、L5和L6与CK果实可滴定酸之间差异显著,增加21.43%～63.45%,其中L2和L1,L3和L4之间无显著性差异,L5可滴定酸增加最少,增加21.43%。果实可滴定酸质量分数:L1>L2>L3>L4>L6>L5。由此可见,苹果树感染银叶病后果实可滴定酸质量分数会增加,通过微生物菌剂与大蒜油配施可降低可滴定酸的质量分数。

可溶性糖:由表3可知,处理L1果实可溶性糖质量分数(13.523%)比CK(16.190%)降低16.47%,差异显著;处理L2、L3和L4与CK果实可溶性糖质量分数之间差异显著,降低8.8%～16.70%;L2、L3和L1,L5和L6之间无显著性差异,L5可溶性糖降低最少,降低0.88%。由此可见,苹果树感染银叶病后果实可溶性糖质量分数降低,通过微生物菌剂与大蒜油配施可增加可溶性糖的质量分数,以L5处理效果较好。

固酸比和糖酸比:由表3可知,果实固酸比和糖酸比处理L1比CK分别降低47.17%和50.05%,差异显著;处理L2、L3、L4、L5、L6与CK果实固酸比差异显著,降低19.81%～44.35%,其中L5和L6之间无显著性差异,L5固酸比降低最少,降低19.81%;处理L2、L3、L4、L5、L6与CK果实糖酸比差异显著,降低18.35%～49.32%,其中L2和L1,L3和L4之间无显著性差异,L5糖酸比降低最少,降低18.35%。由此可见,苹果树感染银叶病后果实固酸比和糖酸比均降低,通过微生物菌剂与大蒜油配施可增加果实固酸比和糖酸比,以L5处理效果较好。

综合表3可知,苹果树感染银叶病后果实硬度、可溶性固形物质量分数、抗坏血酸含量、固酸比、糖酸比均显著降低,可滴定酸质量分数增加。通过微生物菌剂与大蒜油配施,提高了苹果果实硬度、可溶性固形物质量分数、抗坏血酸含量、固酸比、糖酸比,降低了可滴定酸质量分数,且L5效果较好。

3 讨论

本研究发现微生物菌剂与大蒜油配用对患有银叶病的果树叶片有较好的恢复缓和效果,一定程度上提高果实品质。通过观察苹果树1年生枝条叶片形态特征和叶片解剖学特征发现:患银叶病果树叶片褪绿,在阳光下呈银灰色,这与张慧杰[15]、BurgerY[16]对西葫芦银叶病叶片的研究结论相同,还观察到苹果银叶病叶片的叶肉细胞呈墨绿色,这可能是由于叶肉组织厚度随着病害程度的加深而变厚[17],导致细胞间的界限不明显,通过微生物菌剂与大蒜油配施这一现象有所缓解,叶片表观颜色和解剖学特性与正常叶片差别不大。

果树叶型对营养物质的积累有着至关重要的作用,苹果患银叶病后,叶面积、叶周长、大叶长和大叶宽显著减小,只添加微生物菌剂对其影响无显著性差异,通过大蒜油与微生物菌剂配施可有效增加叶片叶面积、叶周长、大叶长和大叶宽。叶片SPAD值可以反映植物叶片中叶绿素含量的相对大小,对叶片的生长具有重要的作用,能够直接反应叶片的健康状况,是用来评价植物长势的有效手段[18]。本研究中患病叶片叶绿素含量降低,通过微生物菌剂与大蒜油配施可提高叶片叶绿素的含量。叶片患银叶病后蛋白质代谢紊乱主要表现在可溶性蛋白含量降低,本研究中患病叶片可溶性蛋白质含量降低,与郝树芹[17]、张立莹[19]研究结果一致。患病后生理代谢失调也加剧糖类物质的消耗,植株发生银叶病后叶片光合速率降低从而导致光合产物减少当消耗大于产出时糖含量降低,本研究患病叶片可溶性糖质量分数降低,与Burger[16]、D.R[20]研究结果一致。苹果树在逆境环境下会产生大量的丙二醛,丙二醛的过多积累能导致细胞死亡,可直接反映植物遭受伤害的程度,本研究中患病叶片丙二醛含量升高,与王彩霞等人[21]研究结果一致。通过微生物菌剂与大蒜油配施增加叶片可溶性蛋白和可溶性糖质量分数,降低丙二醛含量。

苹果果实内在品质是其商品性优劣的重要标志,果实硬度、可溶性固形物、抗坏血酸、可滴定酸、可溶性糖、固酸比、糖酸比均是评价果实品质的重要指标[22]。本研究中通过微生物菌剂和大蒜油配施可改善患病苹果树果实内在品质。

微生物菌剂已被广泛应用在治疗植物有关病原真菌上。Weindling[23]的研究表明木霉菌对植物的病原真菌有着良好的拮抗效果,多年来国外研究者对木霉菌剂的研制做了很多的研究。研究发现,巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)BM1、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis) RC218均能够明显减小小麦赤霉病的发生,还能抑制病原菌毒素的合成[24-25]。大蒜油对病原真菌也有一定的治疗作用。王小青等[9]在患银叶病苹果树体打孔法注入营养液与多菌灵,同时树体打孔注入大蒜油可以治疗苹果银叶病。但本研究中未单独研究大蒜油对患银叶病苹果树叶片生理特性及果实品质的影响,单独使用微生物菌剂时其对患病叶片生理状态恢复及提高果实品质方面不如添加了大蒜油处理效果,随着大蒜油浓度的增加其作用效果也在增加,说明大蒜油在恢复缓解患病树体方面起到了一定的作用,有待下一步继续加强研究。

4 结论

微生物菌剂与大蒜油配用后通过观察1年生枝条叶片表观和纵切面、测定苹果叶片生理特征差异和果实品质分析发现,微生物菌剂与大蒜油配施对银叶病苹果叶片生理特性及果实品质影响较大,配施微生物菌剂2.5 kg /株+大蒜油250 mL /株(处理L5)效果最好。