夹竹桃天蛾胚胎细胞的原代培养

李江怀,占智高,王金昌,郑国华,关丽梅,况文东,陈俊晖,杨 健,靳 亮

(1.江西省科学院微生物研究所,330096,南昌;2.江西省科学院生物资源研究所,330096,南昌)

0 引言

从Grace首次建立昆虫细胞系以来[1],昆虫细胞培养得到了快速的发展。昆虫细胞系成为了生理学、发育生物学和遗传学等学科的重要研究工具[2]。昆虫细胞与杆状病毒表达系统是目前重要的外源蛋白表达工具,对特定病毒敏感的细胞系是探索病毒侵染机制的重要研究材料。昆虫细胞原代培养是一项经典的细胞生物技术, 从2009年到2018年的十年间,昆虫细胞系从500多株增长到了1 000多株,这些细胞系分别来自于100多种昆虫[3],这其中有多种成功被用于商业的昆虫细胞系,例如Sf-9、Sf-21和BTI-TN-5B1-4(High Five)。但目前仍然有大量的昆虫并未建立细胞系,且缺少可供研究的细胞株。

夹竹桃天蛾(Oleander Hawkmoth,Daphnisnerii(Linnaeus)),又名粉绿白腰天蛾、鹰纹天蛾、夹竹桃白腰天蛾,属鳞翅目Lepidoptera,天蛾科Sphingidae,是夹竹桃重要害虫[4]。该虫低温适应能力强,成虫有较强的迁越能力,在全球范围内均有分布,其幼虫能够对夹竹桃等植物造成大面积的侵害,影响夹竹桃生长,甚至造成植株死亡[5]。江西省科学院微生物研究所2015年分离到包含质型多角体病毒DnCPV-NC[6]在内的多株新病毒株[7-8],同时发现DnCPV-NC具有广泛的杀虫谱,具有开发为新型天蛾科害虫生物杀虫剂的潜力[9]。但目前缺乏有效感染的细胞系,因此,本文意在建立一株对上述昆虫病毒敏感的细胞系,为后续开展病毒入侵宿主感染机制提供有效工具。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

1.1.1 实验用虫和细胞系 夹竹桃天蛾虫卵采自江西省南昌市艾溪湖湿地公园夹竹桃林;Sf-9,Tnh5,C6/36细胞系由中科院武汉病毒研究所惠赠,本实验室保存。

1.1.2 主要试剂 Grace’s insect cell medium(美国Gibco公司),RPMI 1640(美国Gibco公司),TNM-FH insect cell medium(Procell公司),DMEM(Sigma公司),Schneider’s Drosophila Medium(Gibco公司),胎牛血清(美国Gibco公司),三抗(100 μg/mL 硫酸链霉素, 100 U/mL 青霉素,2.5 ug/mL两性霉素B,上海生工)。

1.1.3 设备 倒置相差显微镜(上海仪圆光学YYE-700),恒温培养箱(上海新苗GZX-150BS-III),生物安全柜(苏州苏净BHC-1300IIA/B2)。

1.2 实验方法

1.2.1 原代细胞分离 将新鲜采集的夹竹桃天蛾虫卵浸泡于70%乙醇(含1%次氯酸钠)进行表面消毒,然后用双蒸水清洗3遍,用消毒刀片削破卵壳,将胚胎组织释放到无血清培养基当中。用眼科剪小心地切成小块,轻轻吹打,用纱布滤去其中大块的组织。将细胞悬液低速离心后,除去细胞碎片,并加入2 mL含15%FBS及1%三抗的培养基,重悬沉淀,转移至细胞培养板中。

1.2.2 原代细胞和细胞系的培养 28 ℃静置培养,根据培养物的状态,每5—7 d天对原代细胞进行换液,每次更换一半培养基。Tnh5和Sf-9细胞在含10 % FBS的Grace’s培养基中,28 ℃恒温培养,隔3—4 d天传代一次。C6/36细胞用添加15 % FBS的RPMI1640培养基,置于5%的CO2培养箱,28 ℃恒温培养。

1.2.3 细胞形态观察 采用Grace’s培养基?倎28 ℃培养在倒置相差显微镜下,观察细胞形态。

2 结果与分析

2.1 结果

2.1.1 夹竹桃天蛾原代胚胎细胞的分离 采集到虫卵后,将其中色泽鲜艳和卵壳饱满的挑选出来作为同一批次进行原代培养(图1(a))。对新获取的原代培养物进行镜检,可观察到不同的细胞形态,多以圆形油滴状的胚胎干细胞 (图1(b))为主,细胞大小不一,还能观察到较小的细胞团和未成形的组织块(细胞团)。刚转移到培养基中的胚胎细胞以离散状态均匀漂浮在培养液中,其中部分干细胞和细胞团会在最初的24 h内逐渐贴壁。整个原代培养初期,培养液中都悬浮着一定量的离散或成团的细胞,这些细胞几乎不增殖,在一个月内随着培养液的更换而被清除出培养板。

图1 (a)从夹竹桃树叶上采集到的夹竹桃天蛾虫卵 (b)夹竹桃天蛾胚胎细胞形态(100×)(标尺 = 50 μm)

2.1.2 原代培养一周后细胞形态观察结果 选择最适合的培养基是原代培养的关键之一,昆虫细胞系的成功建立高度依赖于培养基和起源组织,尤其是适合细胞类型的培养基[9]。在Grace’s培养基中原代细胞呈长梭型和圆形(图2(a)),和TNM-FH培养基中均有不少胚胎细胞以细胞团的形式贴壁(图2(b)),而Schneider培养基中的细胞贴壁少只能观察到少数细胞团(图2(c)),DMEM和RPMI1640培养基中则难以贴壁(图2(d),(e))。

图2 培养7 d的夹竹桃天蛾胚胎原代细胞(100x) aGrace’s bTNM-FH cSchneider dDEME eRPMI 1640(标尺 = 50 μm)

2.1.3 夹竹桃天蛾原代培中胚胎细胞的分化和形态观察结果 整个原代培养过程,胚胎细胞在形态分化上展现了高度的多样性,多种不同形态的细胞依次出现在培养物当中,最早出现的是长梭形细胞和圆形细胞(图3(a)),通常在细胞贴壁一周后陆续出现在培养物中。纺锤形细胞(图3(b))只存在较短的时间,成纤维状细胞(图3(c))通常在原代培养的第一个月有较快的生长速度,然后就陷入长期的静止状态。少量的豆荚形细胞曾短暂存在过(图3(d)),这些细胞的个体相对其他类型要大出数倍。原代培养初期,可观察到部分肌肉细胞在有节律地跳动(图3(e)),频率约为每分钟20～30次,但这些跳动的细胞通常在2—3个月的培养后逐渐消失在培养物中。此外,还有少量的扁平的圆形细胞(图3(f))和相对较小的颗粒型细胞(图3(g))也被观察到。而成团的细胞周围通常会有些离散出来的多边形细胞(图3(h)),这类细胞大小中等,可明显看到细胞核,细胞的伪足呈不规则多边形。夹竹桃天蛾原代培养细胞与本实验室培养的多种昆虫细胞系,包括Tnh5、sf-9和C6/36等细胞系(图3(i),(j),(k)),在形态与生长速度上存在显著差异。

(a)类脂肪细胞;(b)肌肉细胞;(c)长梭形细胞;(d)成纤维状细胞;(e)圆形细胞;(f)豆荚形细胞;(g)颗粒状细胞;(h)多边形细胞;(i)Tnh5细胞系;(j)Sf-9细胞系;(k)C6/36细胞系(标尺 = 50 μm)图3 夹竹桃天蛾原代细胞培养初期的细胞形态以及与其它昆虫细胞系对比(100×)

2.1.4 长期培养后的细胞状态观察结果 夹竹桃天蛾原代细胞在经过长达一年的原代培养过程,处于相对静止的状态,与外界交换缓慢,培养每7 d更换一次培养液。经过长期的换液后,原代细胞主要呈现肌肉型(图4(a))与多边形(图4(b)细胞为主的混合形态。

图4 夹竹桃天蛾原代细胞培养12Mo(100×)(标尺 = 50 μm)

3 讨论与结论

污染和培养基结晶是原代培养失败的重要原因[10]。以往的研究者对昆虫原代细胞培养的各个技术环节都做了大量的研究和实验,培养基的选择、血清浓度、渗透压、pH等培养条件对细胞贴壁、迁移、增殖的影响[11]。鳞翅目昆虫胚胎细胞系的建立已经比较成熟,基于Grace’s 昆虫培养基和TNM-FH培养基,棉铃虫[12]、小菜蛾[13]、玉米螟[14]等多种昆虫的细胞系得以建立。本研究利用这2种培养基,成功对夹竹桃天蛾卵来源的胚胎细胞进行了持续培养,其中Grace’s培养基中的培养物多为离散分布的细胞,平铺生长,呈现出丰富多样的细胞形态(图3(a)～(f)),其中,纤维状细胞、梭形细胞、肌肉细胞分别约占原代细胞总数的30%、30%和20%,这些细胞在增殖过程中具备一定的迁移能力[15]。TNM-FH中则以聚集的细胞团为主,新生细胞以细胞团为中心呈放射状生长,约占到细胞总量的60%,对于细胞形态多样性的维持弱于Grace’s培养基。由于不确定哪种形态的细胞对昆虫病毒是易感细胞,为保持原代细胞中尽可能多的细胞种类,因而选择Grace’s培养基作为夹竹桃天蛾胚胎细胞的最佳培养基。实验中分离到夹竹桃天蛾胚胎细胞中由大量离散的干细胞组成,因此未进行胰酶消化和机械分散。在对虫卵解剖后,释放到培养液中的即是胚胎干细胞和发育中的组织块。

胚胎、卵巢等的组织是昆虫细胞原代培养最常用到的材料,具有易于获取和分化潜力强等优点。目前已经建立的1 200株昆虫细胞系而言,其中一半来源于胚胎组织,这可能源于胚胎干细胞巨大分化潜能[16]。而中肠、神经系统等组织则难度较大,一方面是因为原代培养过程中的污染难以控制,另一方面可能是分化成熟的组织难以适应体外的培养环境。国内目前仅有一株来源于棉铃虫中肠的细胞系建立成功[17]。虽然昆虫生物学的研究人员在细胞原代培养上取得了很多成果,但并不是每一株细胞系都能成为合适的实验材料。细胞在原代培养过程中的遗传物质可能会发生不确定性的改变,使得原代细胞特性产生与昆虫体内的细胞差异,这些差异对于后续的研究也存在着诸多不可预测的影响。本研究中选择夹竹桃天蛾的虫卵作为原代培养的材料,因其胚胎由坚硬厚实的卵壳保护,最大程度降低了原代培养过程中消毒操作的难度和污染的几率,且成功地在Grace’s培养基中维持了原代细胞存活超过12个月。由于目前夹竹桃天蛾的人工养殖难度较高,原代培养获取的材料主要来自于野生环境,选择虫卵作为原代培养的材料也可尽可能降低被昆虫病毒感染的几率,从而在源头上降低了原代细胞被昆虫病毒感染的风险,在漫长培养过程中持续的观察也证实了这一点。

哺乳动物细胞可通过对肿瘤细胞进行原代培养的方式以快速得到相应的细胞系[18],或采用慢病毒定向整合基因的方式对原代细胞实现永生化[19]。昆虫细胞取材等原因及基础研究不足,难以快速建立需要的细胞系。Li等[20]通过MNNG处理原代细胞实现了化学诱导昆虫细胞转化并建立了细胞系,说明化学诱导的方法对昆虫细胞的转化是可行的。张欣等[21]通过重组杆状病毒在培养体系中引入端粒酶逆转录酶获得了可连续传代的美洲大蠊的细胞系,并显著缩短了原代培养所需的时间。张寰等[22]通过物理或化学低氧的方式来处理原代细胞可诱导其加快转化的进程。这些新开发的手段均为极具潜力的快捷建系方法,并有待于广大研究者的应用和检验。唐凯等[23]通过转录组测序发现原代细胞在离体培养的过程中,cdk4,cycd,skp2和mad1等多个基因与细胞的转化相关,在分子生物学层面为昆虫细胞建系提供了创新的理论基础。本研究探索了对夹竹桃天蛾的胚胎细胞原代培养的条件,通过机械破碎卵壳分离的原代细胞在多种培养基中顺利贴壁,在Grace’s培养基中维持了原代细胞12个月,观察到原代细胞分化出的多种形态,细胞缓慢增殖。原代细胞的鉴定包括DAF-PCR、染色体核型分析及对杆状病毒和DnCPV的敏感性实验需在原代细胞开始传代后展开。以胚胎组织为材料建立的细胞系,细胞形态具备较高的多样性,若能通过单细胞克隆分离出混合在夹竹桃天蛾原代细胞中肌肉细胞、脂肪细胞等细胞株,将为昆虫细胞离子通道和脂类代谢调节机制的研究奠定基础。

建立新的昆虫细胞系和发现新的昆虫病毒一直在昆虫病理研究当中发挥着相辅相成的作用,二者缺一不可。对于昆虫病毒方面的研究人员来说,发现一株新的昆虫病毒,就至少需要有一株相应的敏感细胞系来实现细胞水平的机理研究,这也是下一步开展的工作内容。