醋粉产品微生物抑制效果研究

孟子恒 魏敬远 宋莲军 齐泽倩 乔明武 黄现青 海丹

苯乳酸、甲酸、乙酸、丙酸等是微生物发酵过程中产生的有机酸的主要成分，这些有机酸可以通过降低微生物生长环境体系的pH抑制病原菌生长繁殖，并由此发挥生物防腐作用。在食品行业，由微生物发酵代谢产生的次级代谢产物具有提高食品口感、增强营养、延长保质期等优点，因此将食品发酵产生的次级代谢产物提取制备后用于食品相关的生物防腐，能够有效提高食品的安全性以及消费者的消费信心。

相比于传统的食品抑菌剂对细菌类微生物的抑制作用，作为食品组成成分的发酵醋粉对各类食品中微生物均有不同程度的抑制作用，其营造的酸性环境不利于细菌的生存，可以间接达到杀菌消毒的作用，从而延长保质期并增强产品风味，可广泛应用于酱卤肉、香肠、肉饼等熟肉或熟食制品，面包、吐司等烘焙食品，沙拉酱、酱汁、蘸酱等复合调味品，湿面制品，腌渍蔬菜制品，以及各种风味奶酪的加工等。

本研究采用平板计数法，对比研究了河南伟创生物科技有限公司生产的3种发酵有机酸产品对5种细菌的抑制效果。本实验中所采用的发酵有机酸是基于标签友好成分的天然产品，通过使用非转基因玉米、大米、食用酒精等一种或几种为原料，经过一定周期的液态深层两步发酵，通过喷雾干燥或者真空冷冻干燥获得天然固态调味料，所制备的物质含有有机酸、多酚、维生素、微量元素、酚酸（原儿茶酸、二氢阿魏酸、二氢芥子酸等）、多肽及类黑精等营养成分，以期为食品工业中的杀菌工艺和防腐剂复配提供理论支持。

一、材料与设备

1.菌株与试剂。（1）供试菌株：单增李斯特菌ATCC19115（G+）、曲霉菌、酵母菌、大肠杆菌（G-）、嗜热脂肪芽孢杆菌（G+）。（2）供试试剂：5°发酵醋粉、20°发酵醋粉、液体发酵醋（河南伟创生物科技有限公司），霉菌和酵母菌培养液体，PDA培养基（霉菌和酵母菌固体培养基），LB培养基，琼脂粉，无菌水，盐酸，氢氧化钠，生理盐水（0.85%）。0.1mol/L的氢氧化钠标准滴定溶液：按GB/T 601《化学试剂 标准滴定溶液的制备》，配制与标定0.1mol/L的氢氧化钠标准滴定溶液，0.01mol/L或0.05mol/L的氢氧化钠标准滴定溶液（用时当天稀释）。1%酚酞指示剂溶液：将1g酚酞溶于60mL的95%乙醇（GB/T 679-2002《化学试剂 乙醇》）中，用水稀释至100mL。

2.仪器与设备。DH420恒温培养箱（上海树立仪器仪表有限公司）；FXB303-2恒温培养箱（上海树立仪器仪表有限公司）；生物安全柜（1379）；pH计（PHS-3C）；灭菌锅（KAGOSHIMA SEISAKUSYO INC KG-SX-500）。

二、试验与方法

1.醋粉pH值的测定。根据GB 5009.237-2016《食品安全国家标准 食品pH值的测定》中的方法进行测定。

2.含有发酵醋粉培养基的配制。分别根据空白对照组、0.1%、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%、2.0%、2.5%的抑菌剂（5°醋粉、20°醋粉、液体醋）添加到已灭过菌的固体培养基中，倒平板，备用。

3.指示悬菌液的制备。将用甘油保存的单增李斯特菌按照1%-2%的接种量接种到LB培养基中，在（30±1）℃条件下，以150r/min培养18-24h；将大肠杆菌接种到LB肉汤培养基中，在（37±1）℃条件下，以150r/min培养18h；将嗜热芽孢杆菌在（55±1）℃条件下，以180r/min培养10h；将用甘油保存的根曲霉菌和酵母菌按照1%-2%的接种量接种到霉菌液体培养基中，分别在（29±1）℃和（33±1）℃的条件下，以150r/min培养18h。培养结束后，分别各取1mL菌液，用无菌生理盐水按照1：10的比例稀释到合适的浓度（稀释108）待用。

4.涂布法检测抑菌剂对微生物的抑制。根据国标GB 4789.2-2016涂布法检测抑菌液对微生物的抑制情况，稀释涂布平板法的优点是便于计数和观察菌落特征。

三、结果与分析

1.不同醋粉产品pH值的测定结果。不同醋粉产品pH值的测定结果如表1所示。从表1可以看出，3种产品在100mL无菌水条件下的pH值相同（p＜0.05），添加0.05mL抑菌剂后，20°醋粉和液体醋的pH下降明显；随着抑菌剂体积的不断增加，20°醋粉和液体醋的pH分别持续下降至5.04和5.05。5°醋粉的pH值变化不明显，从不添加抑菌剂时的5.88下降到2.5mL抑菌剂下的5.66。三个呈酸性的固体培养基均不影响后续抑菌结果。

2.不同醋粉产品抑菌率的测定。不同醋粉产品抑菌率的测定结果如图1所示。从图1-A可以看出，5°醋粉在0.6%浓度下对大肠杆菌的抑菌率为83%，对嗜热芽孢杆菌的抑菌率为95%；在2.0%浓度下对酵母菌和霉菌可以达到100%抑菌；针对单增李斯特氏菌，在0.9%浓度下抑菌率为93%，在1.2%浓度下实现100%抑菌。从图1-B可以看出，20°醋粉在0.6%浓度下可以对大肠杆菌和嗜热芽孢杆菌实现100%抑菌；在1.5%浓度下对酵母菌的抑菌率达到100%；在2.0%浓度下对霉菌的抑菌率达到100%；针对单增李斯特氏菌，在0.9%浓度下实现100%抑菌。从图1-C可以看出，液体醋在0.9%浓度下实现对大肠杆菌100%抑菌；在0.9%浓度下实现100%抑菌；在2.5%浓度下对霉菌的抑菌率为55.8%，对酵母菌的抑菌率为56.7%；针对单增李斯特氏菌，在1.5%浓度下实现完全抑菌。

综上，在pH=7.0的中性介质环境下，添加0.6%及以上的5°醋粉对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抑菌率可达100%，添加1.5%及以上对曲霉菌的抑菌率可达100%，添加2.0%及以上对酵母菌的抑菌率可达100%；添加0.3%及以上的20°醋粉对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抑菌率可达100%，添加1.5%及以上对曲霉菌的抑菌率可达100%，添加2.0%及以上对酵母菌的抑菌率可达100%；添加0.6%及以上的液体醋产品对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抑菌率可达90%-100%，添加2.5%及以上对曲霉菌和酵母菌的抑菌率分别为55.8%和56.7%。

四、讨论与结论

微生物污染是影响食品安全的重要因素，应用防腐剂虽可延长食品的保质期，但是化学合成食品防腐剂因其成分及使用量问题，无法打消消费者对其安全存在的疑虑，因此发展天然食品防腐保鲜技术成为必然趋势。有机酸在食品中作为防腐剂和保鲜剂已有数百年的应用历史，具有调节食品风味、抑制病源菌增生、延长食品货架期等多种作用。

本实验通过使用3种发酵有机酸，对食品中常见的3种细菌、霉菌和酵母菌进行体外抑菌试验，结果表明，这3种发酵有机酸均可抑制单增李斯特菌ATCC19115（G+）、大肠杆菌（G-）和嗜热脂肪芽孢杆菌（G+）的生长，其中20°醋粉对几种菌的抑菌效果最好；5°醋粉和20°醋粉在一定浓度下对曲霉菌、酵母菌可以达到100%的灭菌效果；液体醋虽不能达到100%的抑菌效果，但是可以有效抑制霉菌和酵母菌的生存繁殖。值得注意的是，三种产品都需要在较高的浓度范围才能较好地抑制酵母菌和霉菌的生长，而且随着pH值的变化，抑菌能力也不同。

综上所述，本实验以生活中常见的发酵醋粉作为原料，制作3种不同的产品，并明确3种不同产品对5种微生物的抑制效果，有助于后續研发出更为高效的天然产品抑菌剂。不过，目前对于有机酸作用机理的研究还停留在初级阶段，后期仍需要对具体的抑菌作用分子等靶标及其机制进行深入研究。

基金项目：2022年河南省研究生联合培养基地项目（YJS2022JD16）；河南省研究生教育改革与质量提升工程项目（研究生课程思政示范课项目，YJS2023SZ14）；河南省高等学校重点科研项目（23B550001）；河南农业大学本科教育教学改革研究与实践项目：基于“SRPED”四循环可持续实践教学模式的创新与探究。

作者简介：孟子恒（2000-），男，硕士研究生，研究方向为食品微生物安全控制。

*通信作者：海丹（1987-），女，讲师，博士，研究方向为食品营养与安全、食品微生物安全控制。