犊牛轮状病毒RT-LAMP 检测方法的建立与应用

2024-01-09 00:48韩子阳赵洋唐欣如张榕兰冯静萱王嘉羽特木尔巴根郭宇武娅楠张志丹周伟光
当代畜禽养殖业 2023年6期
关键词:轮状病毒犊牛质粒

韩子阳,赵洋,唐欣如,张榕兰,冯静萱,王嘉羽,特木尔巴根,郭宇,武娅楠,张志丹,周伟光*

(1.内蒙古农业大学 兽医学院农业农村部动物疾病临床诊疗技术重点实验室,内蒙古 呼和浩特 010018; 2.中美冠科生物技术有限公司,北京 100000; 3.内蒙古自治区动物疫病预防控制中心,内蒙古 呼和浩特 010020)

轮状病毒(rotavirus,RV)是造成人和动物腹泻最主要的病原体。牛轮状病毒(bovine rotavirus,BRV)是全球范围内造成犊牛腹泻的最主要病原体之一[1]。在大量的犊牛腹泻病例中,BRV 引起的犊牛腹泻发生率最高,约占犊牛腹泻病例的46%,有时高达100%,而死亡率相对较低,通常为10%左右,病畜多死于继发感染[2]。在我国河北、山西、云南、内蒙古、西藏和贵州等地牛群中,BRV 的感染也普遍存在[3]。因此,建立BRV 的快速检测方法成为犊牛腹泻防控的关键环节[4]。

BRV 属于呼肠孤病毒科轮状病毒属,为无囊膜双链RNA 病毒[5],可通过粪口途径传播,多在早春、晚秋、冬季、气候骤变和卫生条件差的情况下发生[6]。该病毒可导致犊牛出现精神萎靡、腹泻和呕吐等临床症状[7]。犊牛出生2 周内,BRV 的分离率高达94%[8],而随着感染牛月龄的增加,其常表现为隐性感染,无明显临床症状,诊断困难,导致养殖过程中易忽视BRV在牛群中的潜在传播,加快疾病蔓延速度。因此,建立有效快速的检测方法,对预防和控制BRV 感染具有重要意义[9]。RT-PCR 是目前检测该病毒最常用的方法,但在应用过程中存在一些不足,如操作复杂费时、局限在实验室操作等,不能完全满足基层快速、准确检测的需求[10]。

环介导等温扩增技术 (loop-mediated isothermal amplification,LAMP) 是一种新型的核酸扩增技术[11],是近年发展起来的一项疾病快速临床诊断方法。LAMP 反应针对靶基因6~8 个区域设计4~6 条引物,仅需一种具链置换活性的DNA 聚合酶 (如Bst、Gsp等)便可在60~66 ℃的恒定温度下实现几十分钟内大于109~1010倍的靶基因扩增[12]。扩增产物可以通过浊度计、电泳和向试管反应中添加荧光染料进行检测[13]。这种变化可以用肉眼观察,非常适合现场检测[14],同时LAMP 方法还有操作条件简单、操作方便的优点。建立快速检测BRV 的RT-LAMP 方法,有助于牛场犊牛腹泻的诊断和防控。

1 材料与方法

1.1 病毒、细菌及样品

牛传染性鼻气管炎病毒 (infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)、牛副流感病毒3 型(bovine parainfluenza virus,BPIV3)、大肠杆菌、沙门菌、BRV 和牛冠状病毒 (bovine coronavirus virus,BCV)由内蒙古农业大学兽医学院兽医传染病学教研室提供;牛腹泻粪样均采自呼和浩特市周边的规模化养牛场,于实验室-80 ℃保存。

1.2 主要试剂

病毒DNA/RNA 基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA 凝胶回收试剂盒和克隆菌DH5α、dNTPs(10 mmol/L) 购自天根生化科技公司;HiScript®II One Step RT-PCR Kit (Dye Plus) 试剂盒购于Vazyme 公司;500 bp 和1 000 bp DNA marker、pMD19-T 购于TaKaRa 公司;Bst 3.0 DNA 聚合酶(8 000 U/mL)、MgSO4(100 mmol/L)、10×ThermoPol反应缓冲液为New England Biolabs 公司产品;SYBR Green I 购自百奥莱博。

1.3 主要仪器

高速冷冻离心机和梯度PCR 仪,德国Eppendorf公司; 台式离心机和生物安全柜,美国Thermo Scientific 公司;凝胶成像仪,英国SYNGENE 公司。

1.4 试验方法

1.4.1 引物设计。参考GenBank 中的BRV NSP 序列,利用软件Lasergene 中的MegAlign 程序对BRV 的多个序列进行比对,根据对比结果利用Primer DesignV5 软件设计合成BRV 的RT-LAMP 反应所需的引物,结果如表1 所示(外引物为F3 和B3,内引物为FIP 和BIP)。

表1 RT-LAMP 扩增BRV 的引物序列

1.4.2 病毒和细菌核酸的提取。核酸提取参照DNA/RNA 基因组提取试剂盒的说明书进行。

1.4.3 BRV RT-LAMP 标准品的制备。用表1 中BRV RT-LAMP 外引物,通过对目的基因进行普通RT-PCR 扩增,反应体系模板为1.4.2 步骤提取的BRV RNA。反应体系:2×One Step Mix 12.5 μL、One Step Enzyme Mix 1.25 μL、F3 1.0 μL、B3 1.0 μL、模板2.0 μL、RNase-free ddH2O 7.25 μL;反应程序:反转录50 ℃30 min; 预变性94 ℃3 min; 变性94 ℃30 s;退火58 ℃30 s;延伸72 ℃30 s;终延伸72 ℃7 min,共35 个循环。参考AxyPreP DNA 凝胶回收试剂盒说明书,获得RT-PCR 纯化产物,将其与pMDTM19-T Vector 进行连接,取10 μL 的连接产物加入100 μL 的DH5α 感受态细胞中进行转化,提取BRV 重组质粒并进行PCR 和测序鉴定计算重组质粒pMD19T-BRV 质粒拷贝数。计算公式:质粒拷贝数(copies/μL)=6.02×(重组质粒浓度ng/μL×10-9)×1023/(660×重组质粒碱基数)。稀释阳性标准品时使用稀释液分别对重组质粒pMD19T-BRV 进行109~100(copies/μL)10 倍梯度稀释制成标准品,于-20 ℃保存。

1.4.4 RT-LAMP 方法的优化。RT-LAMP 方法的反应体系见表2。本试验针对反应体系Mg2+(100 mmol/L)、dNTPs(10 mmol/L)、内引物的用量以及反应条件时间和温度进行优化。其中,不同dNTP 的量分别为0.5、0.8、1.2、1.5 和1.8 μL;不同Mg2+用量分别为0.2、0.5、0.8、1.2 和1.5 μL;不同内引物用量分别为0.5、1、1.5、2 和2.5 μL(内引物浓度为10 μmol/L、外引物用量均为10 μmol/L,0.5 μL); 通过试验的结果选择最佳RT-LAMP 反应体系。反应温度分别采用58.0、60.0、62.0、63.0、64.0、65.0 和66.0 ℃。反应时间分别采用30、45、60、90 和120 min;对RT-LAMP 扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳分析。每次检测时,设置阴性对照(健康牛的基因组DNA);在阴性对照和阳性对照均成立时,整个试验有效,可判定结果。

表2 RT-LAMP 反应体系中各成分及其体积

1.4.5 RT-LAMP 检测BRV 的敏感性。将BRV 重组质粒进行10 倍梯度稀释,用于RT-LAMP 方法对BRV 的敏感性进行检测,并与普通的RT-PCR 对BRV 的敏感性进行比较。

1.4.6 RT-LAMP 检测BRV 的特异性。应用试剂盒提取IBRV、BPIV3、大肠杆菌、沙门菌和BRV 的核酸,以106copies/μL 的pMD19T-BRV 标准品作为阳性对照,通过SYBR Green I 对RT-LAMP 反应体系进行显色反应和凝胶电泳,对BRV 检测方法的特异性进行试验。

1.4.7 RT-LAMP 检测BRV 的重复性。选取终浓度为1×105copies/μL BRV 的重组质粒,运用建立并优化后的BRV RT-LAMP 检测方法,对模板进行3 组重复试验,验证该方法是否稳定。

1.4.8 RT-LAMP 用BRV 的临床检测。利用DNA/RNA 基因组提取试剂盒从腹泻粪样中提取RNA,再运用本试验建立的优化后的RT-LAMP 检测方法和普通RT-PCR 检测方法分别对38 份犊牛腹泻粪样进行检测,并比较这2 种方法的BRV 检出率,验证优化后的RT-LAMP 检测方法是否高效且信任度高。

2 结果与分析

2.1 BRV RT-LAMP 反应体系优化结果

如图1 所示,通过对dNTP(图1A)的用量、Mg2+(图1B)、内引物用量(图1C)、反应时间(图1E)和反应温度(图1D)5 个方面反应体系进行了优化,结果显示,dNTP (10 mmol/L) 最佳用量为2 μL,Mg2+(100 mmol/L)最佳用量为0.8 μL,内引物最佳用量为2 μL,最佳反应温度为62 ℃,最佳反应时间为45 min。

图1 BRV RT-LAMP 反应体系优化结果

2.2 RT-LAMP 检测BRV 敏感性

利用本试验建立的优化后的RT-LAMP 反应体系,对BRV 进行扩增反应,将按倍数稀释的BRV 重组质粒作为模板,同时将普通的RT-PCR 方法用于敏感度的比较。将2 种方法的扩增产物进行凝胶电泳检测,结果如图2 和图3 所示。普通RT-PCR 方法的敏感度为1×103copies/μL,而本试验建立的RT-LAMP方法的敏感度为1×102copies/μL。

图2 RT-PCR 检测BRV 敏感度结果

图3 RT-LAMP 检测BRV 敏感度结果

2.3 RT-LAMP 检测BRV 特异性

利用本试验建立的优化后的RT-LAMP 反应体系,对BRV 检测方法的特异性进行验证,结果如图4所示,只有BRV 的重组质粒有特异性扩增,反观其他细菌、病毒核酸和阴性对照均无特异性扩增,说明本试验建立的这种RT-LAMP 反应体系具有较好的特异性。

图4 RT-LAMP 检测BRV 特异性结果

2.4 RT-LAMP 显色法检测BRV 特异性

利用本试验建立的优化后的RT-LAMP 反应体系,对BRV 检测方法的特异性进行试验,并运用1 000×SYBR GREENⅠ对反应体系进行显色反应。结果如图5 所示,只有BRV 重组质粒显示特异的黄绿色,而其他细菌、病毒核酸和阴性对照为橙色,进一步证实了本试验建立的RT-LAMP 方法具有较好的特异性。

图5 RT-LAMP 显色法检测BRV 特异性结果

2.5 RT-LAMP 检测BRV 重复性

选取终浓度为1×105copies/μL 的BRV 的重组质粒,每种模板重复3 次,进行RT-LAMP 检测反应。如图6 所示,3 组模板对比无较大差异,说明本方法重复性较高,检测结果稳定性较好。

图6 RT-LAMP 检测3 组BRV 重复性结果

2.6 RT-LAMP 检测BRV 临床检测

通过2%的琼脂糖凝胶电泳分析,将本试验建立的BRV RT-LAMP 检测方法和普通RT-PCR 检测方法分别对38 份临床样品进行检测,如图7 和图8 所示,BRV 阳性率分别为47.4%和15.7%。结果证明RT-LAMP 检测方法BRV 的阳性样品检出率高于普通RT-PCR 检测方法。

图7 部分腹泻样品RT-PCR 检测BRV 的结果

图8 部分腹泻样品RT-LAMP 检测BRV 的结果

3 讨论

随着养牛业规模的不断扩大,犊牛轮状病毒感染率不断上升[6],导致犊牛出现大量急性传染性肠道疾病,表现为腹泻、脱水等症状,甚至死亡,给牛场和养殖户带来巨大的经济损失。犊牛腹泻病因复杂,传染性病原包括病毒、细菌和寄生虫等,其中轮状病毒是引起犊牛腹泻的最主要病原之一。普通RT-PCR 检测轮状病毒,由于时间长、操作复杂,需要专业人员、专业设备来进行操作和运行,并不利于基层牧场或兽医人员进行现场快速检测。LAMP 作为一种新型的核酸扩增技术,已逐渐发展成为一种成熟可靠的分子生物学诊断方法,它突出的优势使其在一些国家和地区的病原检测中发挥着重要作用[15]。由于LAMP 在等温条件下扩增,较普通PCR 的三温度循环更简便,且扩增速度要快于普通PCR,故LAMP 用时短、易操作、无需高昂的精密仪器,更有利于现场的快速检测。近几年,研究者基于LAMP 技术开发出了纳米金-LAMP、LAMP-ELISA、电化学生物传感器-LAMP 和数字核酸-LAMP 等方法,提高了LAMP 的特异性和高效性[16]。

本试验通过对RT-LAMP 反应体系的Mg2+(100 mmol/L)、dNTPs(10 mmol/L)、内引物的用量以及反应条件时间和温度进行优化,建立了一种能够快速检测BRV 的RT-LAMP 方法。由于LAMP 扩增中使用的外引物用量较高,可导致一些引物二聚体或不匹配的情况出现,在LAMP 扩增期间出现假阳性的结果,故本试验严格按照LAMP 引物设计的原则,特别注意引物的Tm值、引物末端的稳定性、GC 含量和引物之间的距离[17]来设计引物。RT-LAMP 方法还容易引起交叉污染,本试验通过对实验室严格分区,试剂进行分装,严禁随意丢弃试验垃圾以避免交叉污染。范晴等[11]建立的检测BRV 的二重荧光RT-LAMP 方法,与本试验建立的方法敏感性一致,均有反应条件简单、特异、敏感、快速和稳定等优点。李巍等[18]建立的检测BRV 的RT-LAMP 方法,在等温条件下只需要50 min 就能检测出结果,并能特异地检测BRV,但是未见该方法应用于临床样品的检测。本试验的RTLAMP 检测方法经优化后,敏感性与普通PCR 相比提高了10 倍。在38 份临床样品检测中,RT-LAMP 和普通RT-PCR 方法监测BRV 的阳性率分别为47.4%和15.7%,结果表明,该BRV RT-LAMP 检测方法具有更高的检出率,可以满足快速检测的需要,并且本研究所采用的SYBR GreenⅠ染色方法操作简便、易于观察,为牛轮状病毒的现场快速检测提供技术支持。

综上所述,本试验建立的检测牛轮状病毒的RTLAMP 方法,具有快速、简便、灵敏度高和特异性强等特点,为基层牧场和专业实验室进行牛轮状病毒检测提供了技术支撑。

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