咪达唑仑调节cAMP/PKA/CREB通路对乳腺癌细胞的影响

蒋琦雯，徐杨，姚军，叶棋，任帅帅

1.金华文荣医院麻醉科，浙江金华 321001；2.上海市第六人民医院麻醉科，上海 200233；3.金华市人民医院麻醉科，浙江金华 321302

乳腺癌是一种恶性肿瘤，女性患者占比高达99%，发病率在女性癌症中位居第一[1]。乳腺癌早期可采用保乳手术切除病理组织，但癌细胞增殖快、极易迁移，多发生淋巴结转移造成全身系统疾病，必须采用放、化疗结合方式提高患者的生存率，但放、化疗副作用大且易复发，极大降低患者的生活质量[2]。因此，探索抑制乳腺癌细胞增殖的靶向制剂是临床上改善患者预后的有效途径。

咪达唑仑具有典型的苯二氮䓬类药理活性，具有抗焦虑、镇静、催眠、抗肌肉松弛等作用，多用于治疗失眠和术前诱导睡眠[3]。已有研究表明，咪达唑仑可抑制三阴性乳腺癌MDA-MD-231细胞的增殖、迁移、侵袭和间充质蛋白水平，具有作为治疗乳腺癌候选药物的潜力[4]。研究发现，环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）/蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）/cAMP反应元件结合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）通路可促进肿瘤的发生、侵袭和转移[5]。本研究旨在探讨咪达唑仑对乳腺癌的影响及对cAMP/PKA/CREB通路的调节作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料 三阴性乳腺癌MDA-MD-231细胞株，购自中国科学院上海细胞库。

1.1.2 主要试剂与仪器 马来酸咪达唑仑注射液（批准文号：国药准字H20031037，生产单位：江苏恩华药业股份有限公司，规格：1ml∶5mg）；Sp-cAMPS购自美国MCE公司；胎牛血清购自美国ThermoFisher公司；青霉素链霉素溶液（碧云天生物科技有限公司；规格：100ml/瓶）、DMEM细胞培养基、胎牛血清、4%多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）、BCA蛋白浓度测定试剂盒、磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered solution，PBS）、RIPA裂解液、ECL超敏化学发光液、羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗和结晶紫溶液购自碧云天生物科技有限公司；cAMP酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测试剂盒购自北京正四柏生物科技有限公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐[3-（4，5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-3，5-di- phenytetrazoliumromide，MTT]细胞生长测定试剂盒购自美国Merck公司；Transwell小室购自北京萌壮科技有限公司；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自翌圣生物科技上海有限公司；一抗磷酸化（p-）PKA、PKA、p-CREB、CREB和GAPDH购自美国Abcam公司。CO2培养箱购自德国Memmert公司；细胞板、移液枪、超净工作台、酶标仪，购自美国Thermo Fisher公司；荧光显微镜购自日本Keyence公司；流式细胞仪购自美国Thermo Fisher公司；电泳仪和转膜仪购自北京鸿涛基业科技发展有限公司；Tanon 1600全自动凝胶成像分析仪购自天能集团。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、分组与处理 复苏MDA-MD-231细胞后转入含10%胎牛血清的DMEM细胞培养基中，加入100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素，置于CO2培养箱（5% CO2，37℃）中无菌培养。将细胞传代培养于96孔板中，1.0×105个/孔，随机分为5组：对照组、咪达唑仑L组、咪达唑仑M组、咪达唑仑H组和咪达唑仑H+Sp-cAMPS组，每组设置6个重复孔。咪达唑仑L组、咪达唑仑M组、咪达唑仑H组每孔分别加入5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L咪达唑仑，咪达唑仑H+Sp-cAMPS组每孔中加入20μmol/L咪达唑仑+10μmol/L Sp-cAMPS[4-6]。

1.2.2 MTT法检测MDA-MD-231细胞的增殖能力将1.2.1项的各组细胞传代培养于96孔板中，1.0×105个/孔，每孔加入10%体积的MTT溶液，37℃孵育4h，弃去上清，加入与初始体积等量的Formazan Solvent溶液，MTT甲臜结晶物完全溶解后，使用酶标仪检测450nm处各孔细胞的光密度（optical density，OD），细胞增殖能力与OD值成正比。

1.2.3 细胞划痕试验检测MDA-MD-231细胞的迁移能力 将1.2.1项的各组MDA-MD-231细胞接种至6孔板，1.0×106个/孔，用移液器枪头垂直画一条线并标记不同分区，在0h和48h拍照，计算愈合效率即细胞迁移能力。愈合效率=（0h时细胞划痕面积－48h时细胞划痕面积）/0h时细胞划痕面积。

1.2.4 Transwell实验检测MDA-MD-231细胞的侵袭能力 将1.2.1项的各组MDA-MD-231细胞稀释10倍，接种于Transwell小室，3×103个/室，置于37℃培养箱孵育60min。每个小室加入200μl基本培养基和700μl完全培养基，孵育过夜，再加入4% PFA和0.1%结晶紫溶液，荧光显微镜下拍照并计算细胞侵袭能力。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 在1.2.1项的各组细胞中加入0.25%胰蛋白酶，配制浓度为1×109个/L的细胞悬液，加入100μl细胞悬液至Falcon试管中，再加入5μl Annexin V-FTTC和5μl碘化丙啶（propidium iodide，PI），避光孵育15min，最后加入结合缓冲液静置1h，流式细胞术检测细胞凋亡情况。统计Q2区细胞占比作为MDA-MD-231细胞凋亡率。

1.2.6 ELISA检测细胞cAMP的表达 在1.2.1项的各组细胞中加入PBS混悬液，按ELISA试剂盒说明书配制待测标准品和样品溶液，读取酶标仪450nm波长处的吸光度，根据标准曲线计算样品中的cAMP浓度。

1.2.7 蛋白免疫印迹检测p-PKA、PKA、p-CREB、CREB蛋白表达 收集1.2.1项的各组MDA-MD-231细胞，提取细胞总蛋白并定量总蛋白浓度，随后采用蛋白免疫印迹（Western blot）法验证蛋白的表达。配制SDS-PAGE凝胶，上样10μg，电泳参数设为80V通电30min后转为120V通电1h。取下凝胶，200V电压下将已分离的条带转至聚偏氟乙烯（poly-vinylidene fluoride，PVDF）膜。封闭后的PVDF膜分别置于p-PKA、PKA、p-CREB、CREB（1∶1 000）和GAPDH（1∶2 000）过夜，再经二抗（1∶500）和ECL超敏化学发光液孵育，使用Tanon 1600软件拍照并分析蛋白表达水平。

1.3 统计学方法

采用GraphPad Prism 8.0.2统计学软件对数据进行处理分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验及单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞增殖情况的比较

与对照组比较，咪达唑仑L组、咪达唑仑M组、咪达唑仑H组细胞的增殖能力显著降低（P<0.05）；与咪达唑仑H组比较，咪达唑仑H+Sp-cAMPS组细胞的增殖能力显著提高（P<0.05），见表1。

表1 各组细胞OD450值比较（±s，n=6）

表1 各组细胞OD450值比较（±s，n=6）

注：与对照组比较，*P<0.05；与咪达唑仑H组比较，#P<0.05

组别 OD450值对照组 1.62±0.13咪达唑仑L组 1.35±0.14*咪达唑仑M组 1.09±0.12*咪达唑仑H组 0.83±0.07*咪达唑仑H+Sp-cAMPS组 1.40±0.13#F 38.282 P <0.001

2.2 各组细胞迁移能力的比较

与对照组比较，咪达唑仑L组、咪达唑仑M组、咪达唑仑H组细胞的迁移能力显著下降（P<0.05）；与咪达唑仑H组相比，咪达唑仑H+Sp-cAMPS组细胞的迁移能力显著提高（P<0.05），见图1和表2。

图1 细胞划痕试验检测MDA-MD-231细胞的迁移能力

表2 各组MDA-MD-231细胞的迁移能力比较（±s，n=6）

表2 各组MDA-MD-231细胞的迁移能力比较（±s，n=6）

注：与对照组比较，*P<0.05；与咪达唑仑H组比较，#P<0.05

组别 细胞迁移率（%）对照组 96.11±10.43咪达唑仑L组 82.26±8.18*咪达唑仑M组 73.75±7.14*咪达唑仑H组 61.54±7.79*咪达唑仑H+Sp-cAMPS组 90.24±12.26#F 12.789 P <0.001

2.3 各组细胞侵袭能力的比较

Transwell实验结果表明，与对照组比较，咪达唑仑L组、咪达唑仑M组、咪达唑仑H组细胞的侵袭能力显著下降（P<0.05）；与咪达唑仑H组比较，咪达唑仑H+Sp-cAMPS组细胞的侵袭能力显著提高（P<0.05），见图2和表3。

图2 Transwell实验检测各组MDA-MD-231细胞的侵袭能力（×100）

表3 各组MDA-MD-231细胞的侵袭能力比较（±s，n=6）

表3 各组MDA-MD-231细胞的侵袭能力比较（±s，n=6）

注：与对照组比较，*P<0.05；与咪达唑仑H组比较，#P<0.05

组别 细胞侵袭率（%）对照组 91.16±9.38咪达唑仑L组 78.25±7.23*咪达唑仑M组 74.67±8.64*咪达唑仑H组 62.74±9.53*咪达唑仑H+Sp-cAMPS组 88.43±8.67#F 10.248 P <0.001

2.4 各组细胞凋亡率的比较

与对照组比较，咪达唑仑L组、咪达唑仑M组、咪达唑仑H组细胞凋亡率显著提高（P<0.05）；与咪达唑仑H组比较，咪达唑仑H+Sp-cAMPS组细胞凋亡率显著降低（P<0.05），见图3和表4。

图3 流式细胞术检测各组细胞凋亡率

表4 各组MDA-MD-231细胞凋亡率比较（±s，n=6）

表4 各组MDA-MD-231细胞凋亡率比较（±s，n=6）

注：与对照组比较，*P<0.05；与咪达唑仑H组比较，#P<0.05

组别 细胞凋亡率（%）对照组 2.76±0.34咪达唑仑L组 4.12±0.36*咪达唑仑M组 6.87±0.84*咪达唑仑H组 12.71±1.58*咪达唑仑H+Sp-cAMPS组 3.11±0.26#F 145.374 P <0.001

2.5 各组细胞cAMP表达水平的比较

咪达唑仑L组、咪达唑仑M组、咪达唑仑H组细胞的cAMP表达水平均显著低于对照组（P<0.05）；与咪达唑仑H组比较，咪达唑仑H+Sp-cAMPS组细胞的cAMP表达水平显著升高（P<0.05），见表5。

表5 各组细胞cAMP表达水平的比较（±s，n=6）

表5 各组细胞cAMP表达水平的比较（±s，n=6）

注：与对照组比较，*P<0.05；与咪达唑仑H组比较，#P<0.05

组别 浓度（pmol/ml）对照组 8.52±1.01咪达唑仑L组 6.45±0.74*咪达唑仑M组 4.81±0.54*咪达唑仑H组 2.77±0.36*咪达唑仑H+Sp-cAMPS组 7.51±0.88#F 56.132 P <0.001

2.6 各组细胞蛋白表达水平的比较

与对照组比较，咪达唑仑L组、咪达唑仑M组、咪达唑仑H组细胞的p-PKA/PKA、p-CREB/CREB蛋白表达水平显著下降（P<0.05）；与咪达唑仑H组比较，咪达唑仑H+Sp-cAMPS组细胞的p-PKA/PKA、p-CREB/CREB蛋白表达水平显著升高（P<0.05），见图4和表6。

图4 Western blot检测细胞中p-PKA、PKA、p-CREB、CREB蛋白的表达

表6 细胞中p-PKA/PKA、p-CREB/CREB蛋白表达水平的比较（±s，n=6）

表6 细胞中p-PKA/PKA、p-CREB/CREB蛋白表达水平的比较（±s，n=6）

注：与对照组比较，*P<0.05；与咪达唑仑H组比较，#P<0.05

组别 p-PKA/PKA p-CREB/CREB对照组 0.84±0.11 0.98±0.08咪达唑仑L组 0.70±0.09* 0.83±0.07*咪达唑仑M组 0.58±0.07* 0.69±0.07*咪达唑仑H组 0.33±0.04* 0.37±0.03*咪达唑仑H+Sp-cAMPS组 0.79±0.10# 0.88±0.09#F 33.817 66.726 P <0.001 <0.001

3 讨论

乳腺癌起源于乳腺上皮组织，临床表现为乳房肿块、泌乳障碍、局部扩散可侵及周围淋巴管，全身转移可累及脏器和骨组织，甚至导致死亡[7]。三阴性乳腺癌是乳腺癌中比较常见的一种病理亚型，具有较高的发病率[8]。目前，临床上还没有靶向治疗乳腺癌、有效防治复发的方法，因此寻找疗效好、安全性高的新型药物，提高乳腺癌患者的生存率和生活质量势在必行。

咪达唑仑不仅可作为镇定剂用于外科手术，还可抑制多种肿瘤的进展。咪达唑仑能通过上调miR-217抑制肝癌细胞的转移并促进凋亡[9]；还能抑制胰腺导管腺癌细胞增殖，抑制肿瘤相关嗜中性粒细胞、巨噬细胞和多形核骨髓来源细胞的局部浸润，进而抑制胰腺导管腺癌进展[10]；也能抑制非小细胞肺癌细胞增殖和活力[11]。本研究发现5μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L咪达唑仑处理后的三阴性乳腺癌MDA-MD-231细胞数量减少、生长状态变差，显示出凋亡迹象；通过MTT法、细胞划痕试验和Transwel实验检测发现，咪达唑仑剂量依赖性降低MDA-MD-231细胞的增殖、迁移和侵袭能力，且细胞凋亡率升高，说明咪达唑仑可有效抑制MDA-MD-231细胞的活力。

cAMP广泛存在于细胞中，多种激素、神经递质及其他信号分子将其用作细胞内第二信使，因此，cAMP可直接调控细胞的各种生物学行为，包括细胞代谢、生长、分化、凋亡和基因表达等[12]。PKA是一种四聚体酶，可使底物磷酸化促进癌细胞侵袭和转移[13]。CREB是PKA的底物之一，cAMP可通过调节多种靶基因的转录，调控PKA及其下游因子CREB，影响肿瘤的发生和发展[14-15]。本研究中，咪达唑仑处理后的MDA-MD-231细胞cAMP、p-PKA/PKA、p-CREB/CREB蛋白表达水平下降，说明咪达唑仑可抑制cAMP/PKA/CREB信号通路。咪达唑仑对MDA-MD-231细胞增殖、迁移和侵袭能力的抑制可能通过抑制cAMP/PKA/CREB信号通路激活实现。为验证咪达唑仑对MDA-MD-231细胞活力的抑制确实与抑制cAMP/PKA/CREB信号通路有关，本研究增设咪达唑仑H+Sp-cAMPS组。Sp-cAMPS是一种依赖cAMP的PKA有效激活剂[16]。相较于咪达唑仑H组，咪达唑仑H+Sp-cAMPS组MDA-MD-231细胞生长状态好转，增殖、迁移和侵袭能力显著增加，细胞凋亡率降低，cAMP/PKA/CREB信号蛋白表达上调，表明经Sp-cAMPS处理增加MDA-MD-231细胞活力及cAMP/PKA/CREB信号，也印证咪达唑仑抑制MDA-MD-231细胞的增殖、迁移和侵袭与其抑制cAMP/PKA/CREB信号激活有关。

综上所述，咪达唑仑可通过抑制cAMP/PKA/CREB信号通路的激活抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。然而，cAMP/PKA/CREB信号通路与肿瘤之间的作用复杂，需要考虑具体的肿瘤类型和背景，有研究报道，在肝癌中降低cAMP的浓度和CREB的磷酸化程度，导致癌细胞凋亡[17]。因此，关于cAMP/PKA/CREB在乳腺癌和其他类型肿瘤中的调控机制还需深入探究。