基于网络药理学的积雪草酸治疗IA1期宫颈癌治疗机制的研究

张军丹,秦海霞,张运峰,李华伟

(1.新乡医学院第一附属医院 妇产科,河南 新乡 453100;2.唐山师范学院 生命科学系,河北 唐山 063000;3.唐山师范学院 科研处,河北 唐山 063000)

宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤之一,2020年全球女性宫颈癌新发60.4万例[1]。宫颈癌延迟诊治可对预后产生不利影响,因此癌前病变和宫颈癌早期阶段的识别和诊治至关重要。IA1期宫颈癌的诊治对女性生育能力至关重要[2],研究IA1期宫颈癌的核心靶点对指导后期药物开发具有重要意义。

网络药理学是以系统生物学理论为指导,综合生物信息学、多向药理学、计算机科学等多学科技术,系统研究药物和疾病之间的相互作用[3]。网络药理学的拓扑分析与生物学中多途径、多靶点、系统调控的特点相符,已成为药物开发的新工具[4],在天然植物功能性成分靶点筛选和作用机制研究方面应用广泛[5]。

积雪草酸(Asiatic acid)是中草药积雪草的功能成分,属游离三萜酸,可通过p53/FAK信号通路抑制舌鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭[6],诱导肝癌细胞凋亡[7]。积雪草酸对不同癌症类型的作用机制存在差异,研究积雪草酸对IA1期宫颈癌的作用靶点,有助于弄清作用机制,指导药物设计和开发。

1 村料与方法

1.1 作用靶点收集

以“Asiatic acid”(积雪草酸)为关键词,在Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、ETCM(http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/)、Super-PRED(https://prediction.charite.de/)和SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)数据库中,检索积雪草酸的作用靶点,去除重复项,用String数据库(https://cn.string-db.org/)对靶点进行标准化处理。

1.2 差异表达基因筛选

在GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中,以“Cervical Cancer”(宫颈癌)为关键词进行检索与筛选数据集,经GEO2R分析,获得差异表达基因。

1.3 药物作用与IA1期宫颈癌的靶基因交集

在Venny(https//bionfogp.cnb.csic.es/tools/venny/indx.html)数据库中对积雪草酸靶点和宫颈癌差异基因相互映射,得到积雪草酸治疗IA1期宫颈癌的潜在靶点集。

1.4 蛋白互作(PPI)网络构建

将靶基因交集载入String数据库,选择Homo sapiens,获得PPI网络,分析网络的整体效果。

1.5 GO功能分析及KEGG通路分析

将靶点交集载入DAVID数据库(https://david.ncice.gov/home.jsp)进行GO(gene ontology)功能分析和KEGG通路分析。

1.6 调控机制网络构建与分析

建立化合物、信号通路、治疗IA1期宫颈癌潜在靶点的节点属性表,导入Cytoscape3.10.1软件中,建立“化合物-通路-疾病靶标”网路。

1.7 分子对接

选择“化合物-通路-疾病靶标”网络中的核心靶点与积雪草酸进行分子对接,利用RCSB PDB数据库(htt://www.rcsb.org)获取核心靶点的PDB结构,从Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)中获取积雪草酸的PDB结构,利用AutoDock Tools1.5.6软件完成分子对接验证。

2 结果与分析

2.1 积雪草酸与IA1期宫颈癌相关靶点筛选

从Pubchem、ETCM、Super-PRED和SwissTargetPrediction共检索获得667个积雪草酸作用靶点,在GEO数据库获得宫颈癌数据集GSE223804(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/?term=GSE223804),以正常宫颈细胞为对照(n=2),IA1期宫颈癌细胞为处理(n=4),经GEO2R分析,获得998个差异表达基因。对积雪草酸靶点与IA1期宫颈癌差异表达基因取交集,共获得60个靶点交集。

2.2 GO功能富集分析

靶点交集的GO功能富集分析结果表明,60个靶点显著富集于50个生物过程(Biological Process,BP)、23个细胞组分(Cellular Component,CC)和28个分子功能(Molecular Function,MF),TOP 10如图1所示。生物过程主要涉及细胞增殖负调控过程(negative regulation of cell proliferation)、免疫反应过程(immune response)和G蛋白偶联受体信号通路(G-protein coupled receptor signaling pathway),细胞组分主要为:细胞膜(plasma membrane)、细胞核(nucleus)和膜固有组分(integral component of membrane),主要分子功能有离子锌结合(zinc ion binding)、金属离子结合(metal ion binding)、ATP结合(ATP binding)和血红素结合(heme binding)。以上结果表明,与IA1期宫颈癌相关的交集靶点可在不同细胞组分,通过多种生物学过程,发挥不同分子功能。

图1 积雪草酸治疗宫颈癌关键靶点的GO富集分析

2.3 KEGG通路分析

对交集靶点进行KEGG通路分析共得到30条信号通路,对前20条信号通路用桑基气泡图进行可视化,如图2所示。积雪草酸治疗宫颈癌所涉及的生物学通路主要包括炎症性肠病(Inflammatory bowel disease)、人巨细胞病毒感染(Human cytomegalovirus infection)、TNF信号通路(TNF signaling pathway)、NF-κB信号通路(NF-kappa B signaling pathway)、脂质和动脉粥样硬化(Lipid and atherosclerosis)和Toll样受体信号通路(Toll-like receptor signaling pathway)等。

图2 交集靶点的KEGG通路富集注:根据q值排序,值越小,颜色越红,则富集程度越高;气泡越大、count值越大

2.4 PPI网络

将60个交集靶点载入String蛋白数据库,评定靶点间的连接性能。物种选定Homosampine,设定中等强度置信区间(0.4),进行蛋白互作分析,去除孤立靶点,得到PPI网络(图3)。结果显示,60个靶点,125条边,平均节点度值4.17,平均局部聚类系数0.517,期望边值为41,PPI富集值P<1.0e-16,网络相互作用显著。从图3中可以看出,连线较多的节点主要包括CCL2、CXCL8、IL1B、TLR4以及SMAD3等。

图3 蛋白质相互作用关系网络图

图4 积雪草酸调控IA1期宫颈癌潜在机制网络图注:圆形代表靶点,菱形代表信号通路,图形大小代表相应度值,中心为积雪草酸,颜色越深,表示成为核心靶点的可能性越大

2.5 调控机制网络图

将化合物、交集靶点、信号通路建立节点属性表,载入Cytoscape,去除孤立靶点,得到积雪草酸治疗IA1期宫颈癌潜在机制图(图4),利用Network Analysis工具进行拓扑学分析,以大于靶点度值中位数2倍为筛选标准,获得积雪草酸调控IA1期宫颈癌的核心靶点为:TLR4、CCL2、IL1B、CXCL8。

2.6 积雪草酸与核心靶点对接验证

小分子化合物与蛋白大分子结合能小于0,且结合能越低,结合的可能性越大。利用AutoDock Tools1.5.6软件对核心靶点TLR4、CCL2、IL1B、CXCL8与积雪草酸进行分子对接(图5)。结果发现,4个核心靶点与积雪草酸的结合自由能分别为:-7.2、-6.4、-8.7和-6.0 kcal/mol,说明受体蛋白和积雪草酸可以形成稳定复合物。积雪草酸与TLR4中的氨基酸残基ASN-579、GLY-617、CYS-609、GLU-608形成氢键;与CCL2中的氨基酸残基CYS-34形成氢键;与IL1B中的氨基酸残基LEU-74、MET-77、VAL-79形成氢键;与CXCL8中的氨基酸残基LYS-50形成氢键。上述结果提示这些核心靶点在积雪草酸治疗IA1期宫颈癌过程中发挥重要作用,是积雪草酸治疗IA1期宫颈癌的重要靶标。

A B

C D图5 积雪草酸与核心靶点分子对接(A)TLR4、(B)CCL2、(C)IL1B和(D)CXCL8

3 讨论和结论

利用网络药理学发现了60个积雪草酸与IA1期宫颈癌的交集靶点,多分布在细胞膜、细胞核、膜固有组分等位置,通过结合锌离子、ATP、血红素发挥功能,主要涉及细胞增殖负调控过程、免疫反应过程、G蛋白偶联受体信号通路等生物过程,与炎症因子、免疫抵抗、细胞应激、血管内皮损伤和免疫细胞活化等相关[8-10]。“化合物-通路-疾病靶标”网络分析和分子对接验证结果发现,IL1B、TLR4、CXCL8和CCL2等4个核心靶点在促炎、免疫逃逸、激活免疫过程和细胞浸润中发挥重要作用。血液单核细胞和组织巨噬细胞在急性和慢性炎症中产生的IL1B,促进肿瘤发生[11]。宫颈癌进一步诱导单核细胞产生IL1B,而高表达IL1B的肿瘤患者通常预后不良、总生存期较短[12]。TLR4可能与Foxp3联合促进IA1期宫颈癌免疫逃逸[13]。CXCL8则通过调节基质金属蛋白酶MMP2和MMP9的分泌,促进癌细胞的浸润、迁移和转移[14]。趋化因子CCL2吸引和激活单核细胞、巨噬细胞及其它炎症相关细胞,参与调节炎症和免疫细胞的迁移,向巨噬细胞中添加CCL2可以增强其抗肿瘤活性[15]。周围神经系统中的神经胶质细胞分泌CCL2能招募单核细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞[16],促进神经元兴奋性和神经修复[17],调节宫颈癌的神经浸润[18]。鉴于4个核心靶点的复杂生物过程,研究积雪草酸对四个核心靶点的调控作用时,需要注意用法、用量和联合用药。