荔枝中丁虫腈、丁香菌酯、氯啶菌酯、乙唑螨腈4种农药残留的定量检测方法

韦龄乾，潘喜芳，蒋扬柏，黄全书，卢希源

（钦州市农产品质量安全检测中心 广西钦州 535000）

丁虫腈[1-4]对菜青虫、小菜蛾、螟虫、粘虫、褐飞虱、叶甲等害虫具有高活性，并有较好的防治效果，在水稻、蔬菜上的应用空间巨大，发展潜力广阔，目前只发现有在大米和油菜中的农残检测方法。

丁香菌酯对瓜果、蔬菜、果树的霜霉病、晚疫病、黑星病、炭疽病、叶霉病有效，同时对轮纹病、棉花枯萎病、水稻瘟疫病、纹枯病及小麦根腐病、玉米小斑病亦有效，目前未发现有在农作物上的农残检测方法。

氯啶菌酯是一种高效、广谱、低毒杀菌剂，具有预防及治疗作用；其杀菌谱广、活性高、对非标生物及环境相容性好、持效期长、对作物安全等。目前未发现有在农作物上的农残检测方法。

乙唑螨腈[5]可有效防治螨卵、幼螨、若螨、成螨，因此发展潜力广阔，目前只发现此种农药在枸杞中的农残检测方法。

以上4 种农药均是由我国自主开发研制的农药，并且已获得中国专利和PCT 专利，发展潜力广阔，具有良好的商品化开发前景和竞争优势，但是目前缺少这4 种农药在蔬菜、水果上的残留检测方法。因此，研究丁虫腈、丁香菌酯、氯啶菌酯、乙唑螨腈的农残检测方法具有非常重要的意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验样品：荔枝（来源于钦州市一荔枝生产绿色防控试验基地），此处荔枝不喷施任何农药。

标准物质：丁虫腈［来源于农业农村部环境保护科研监测所（天津）］，丁香菌酯（来源于上海安谱实验科技股份有限公司），氯啶菌酯（来源于德国Dr.Ehrenstorfer公司），乙唑螨腈（来源于北京曼哈格生物科技有限公司）。

其他试剂：乙腈（HPLC，Tedia Company），甲醇（HPLC，Tedia Company），乙酸铵(LC-MS 级，CNW Technologies)，无水甲酸（LC-MS级，天津市光复科技发展有限公司），超纯水（Millipore 超纯水机制备），微孔滤膜（0.22 μm，Agela Technologies）。Quechers 提取包（品牌：艾吉尔。内含4 g 无水硫酸镁，1 g氯化钠，0.5 g柠檬酸氢二钠，1 g柠檬酸钠）；提取柱（品牌：艾吉尔）。

1.2 主要仪器设备

液相色谱仪串联三重四极杆质谱(型号：LCMS-8040，岛津SHIMADZU公司)，台式高速离心机（Sigma 3K15曦玛离心机有限公司），台式微量离心机(赛默飞世尔科技公司)，电子天平（型号：JJ1000，精确度0.001 g，美国双杰兄弟有限公司常熟双杰测试仪器厂），多管涡漩混合仪（AS-02040-00，杭州奥盛仪器有限公司），振荡器（Ika VXR Basic，德国IKA），移液枪（赛默飞世尔科技公司）。

1.3 试验方法

目前我国常用的检测蔬菜、水果中的农药残留方法包括国家标准GB/T 20769—2008，NY/T 761—2008、GB/T 23200—113、GB/T 23200—121等，常用的前处理方法有匀浆萃取法、Quechers 处理法[6-9]，定量检测仪器常用色相、液相色谱仪，气相液相串联质谱仪。匀浆萃取法前处理操作繁琐，费时费力，成本高，不适合大批量样品的快速定性及定量分析，而Quechers 方法是一种快速、简单、廉价、高效、耐用、安全的样品前处理方法，近年来已广泛用于食品中农药残留量的检测。因此，本文选择应用Quechers方法-超高效液相-串联质谱仪同时检测蔬菜水果上丁虫腈、丁香菌酯、氯啶菌酯、乙唑螨腈农药残留量。

1.3.1 标准溶液配制

用丁虫腈、丁香菌酯、氯啶菌酯、乙唑螨腈标准物质，以乙腈为溶剂，配制成浓度为10 u g/mL的混合标准溶液，于-14 ℃避光冷藏储存备用，以便作为标准曲线溶液配制和添加回收用。本次实验曲线标点配置0.02、0.04、0.08、0.12、0.24、0.48 u g/mL 等6 个浓度梯度，为检验是否受基质效应影响，应用2种不同溶剂配制标准曲线溶液，一是用乙腈作为溶剂配制（溶剂标），二是用样品前处理后得到的空白基质溶液配制（基质标），最后比较2 种情况下标准曲线的线性范围、相关系数以及2 条标准曲线定量准确性。

1.3.2 样品前处理

提取：准确称取10.00 g荔枝（匀浆状）样品放入50 mL离心管，准确加入10.00 mL乙腈及提取包粉末，并加入一颗陶瓷均质子，于振荡器剧烈振荡（2 min以上）后，置于5 000 r/min的离心机中离心5 min。

净化：准确吸取1 mL 上清液置于内含除水剂和净化材料的提取柱中（每1 mL提取液使用150 mg无水硫酸镁，25 mg 乙二胺-N-丙基硅烷），漩涡混匀1 min，5 000 r/min 离心5 min。将上清液通过0.22 μ m微孔滤膜过滤，供LC-MS/MS分析。

1.3.3 添加回收试验

本文以荔枝为基质，做6个梯度浓度的添加，每个浓度梯度做2个重复，具体如下：

采集4 kg荔枝样品，去核后用搅拌机捣碎至匀浆状态，准确称取13 个（10±0.05 g）荔枝样品（匀浆状）于50 mL 离心管中，一个做空白样CK，其余12个样品做质控样品，分别制作0.02、0.04、0.08、0.12、0.24、0.48 mg/kg 6 个浓度的添加回收，编号分别为A、B、C、D、E、F，其中每个添加浓度做2个平行。质控样添加完成后静置30 min，待样品充分吸收标液后，按照样品前处理（1.3.2）步骤准确操作。将此步骤所得的样品移到液相色谱仪串联三重四极杆质谱上进行检测，每个样品进样2次，最后用基质标液曲线和溶剂标液曲线分别定量（外标法）。

1.3.4 色谱-质谱条件

色谱条件：SHIMADZU C18柱子，谱柱（Φ1.9 μ m，2.1 mm×100 mm）；柱温为常温；流速0.4 mL/min；进样量1 μ L；流动相A 为0.5 mmol/L 醋酸铵+0.01%甲酸水溶液，流动相B为甲醇；洗脱方式，有机相初始浓度为20%，5 min有机相浓度为50%，24～26 min设置95%（详见表1）。

表1 液相色谱中流动相洗脱梯度条件

质谱条件：采用电喷雾离子化模式（ESI）；扫描模式为多反应监测（MRM）；离子源接口电压，ESI+为+4.5 kV；ESI-为-3.5 kV；雾化气为氮气，3 L/min；干燥气为氮气15 L/min；碰撞气为氩气；DL管温度为250 ℃；加热模块温度为400 ℃；

对4 种农药单标溶液进行质谱参数优化，确定特征母离子和子离子，优化后的相关质谱参数见表2。图1 为丁虫腈、丁香菌酯、氯啶菌酯、乙唑螨腈TIC离子流图，从图像上可看出0.02 u g/mL浓度下丁香菌酯、氯啶菌酯、乙唑螨腈相应强度均在3万以上，氯啶菌酯高达6万以上，4种农药在在图谱中基线平稳，杂峰少，峰型呈正态分布，半峰宽正常。虽然丁虫腈响应值不到1万，但从响应值和重现性高等方面看，并不影响定量准确。

图1 丁虫腈、氯啶菌酯、丁香菌酯、乙唑螨腈浓度为0.02 u g/mL TIC离子流图

表2 丁虫腈、氯啶菌酯、丁香菌酯、乙唑螨腈4种农药优化的质谱参数

2 结果与分析

2.1 提取条件的选择

在农药残留分析中，常用提取溶剂有乙腈、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷等。本文以荔枝（匀浆状）样品为研究对象，考察了4 种提取剂对4 种农药的提取效果。通过实验发现：丙酮提取时的分层效果不明显，盐析效果不如乙腈；二氯甲烷提取杂质较多，且溶剂极易挥发；乙酸乙酯的回收率虽能满足要求，但与乙腈相比杂质较多，干扰更大；而乙腈的提取效率高，在去除糖分杂质方面效果较好。综合考虑，本文选择乙腈作为提取溶剂最为合适。

2.2 净化条件的选择

农残检测中常用的固体吸附剂有C18、GCB（石墨化碳黑）和PSA（N-丙基乙二胺）。C18主要用于吸附油脂等弱极性杂质。GCB 虽适用于去除蔬菜中的色素等干扰，但实验发现待测物损失较多。PSA 能有效去除各种有机酸、色素、脂肪等物质的干扰，可获得良好回收效果。从节约成本、提高净化效果的角度综合考虑，本文采用PSA 做吸附剂。

2.3 质标和溶剂标两条标准曲线的线性范围、相关系数、标准曲线图

本实验通过准确配制0.01、0.02、0.04、0.08、0.12、0.24 u g/mL 和0.48 u g/mL 的丁虫腈、丁香菌酯、氯啶菌酯、乙唑螨腈混合溶剂标夜和基质标液，每个浓度梯度连续重复测定6次，测试其相关系数、重现性和准确度。结果显示，在0.01 u g/mL浓度下，4种农药的重现性不好，因此检出限0.01 u g/mL，在0.02～0.48 u g/mL 线性范围下，4 种农药的溶剂标和基质标线性方程相差不大，溶剂标相关系数R2≥0.999 41，基质标相关系数R2≥0.999 38（见表3）。基质标工作曲线如图2—图5。

图2 丁虫腈工作曲线

图3 丁香菌酯工作曲线

图4 氯啶菌酯工作曲线

图5 乙唑螨腈工作曲线

表3 4种农药的线性范围、线性方程、相关系数（n=6）

2.4 基质效应探索

使用标准GB/T 20769—2008、NY/T 761—2008、GB/T 23200—113、GB/T 23200—121 规定的检测方法，甲胺磷、氧乐果等非极性农药会出现基质效应，为了探索基质效应影响，本文使用样品前处理中空白样品所得的溶液配置基质标液，并与溶剂（乙腈）标的精确度、样品添加回收率进行对比，以此来判断基质效应的影响，消除误差。

从表4、表5可以看出，2种定量方式中，不管是哪个浓度的添加，结果平行度相当可观，且结果接近理论添加值，另外，在0.02 mg/kg的添加浓度上，4种农药的回收率均接近100%，足以证明此检测方法精密度相当高。

表4 13个荔枝样品的检测结果（溶剂标定量）

表5 13个荔枝样品的检测结果（基质标定量）

从回收率和标准偏差来看，如表6显示：2种定量方式中，不管在哪个添加浓度水平下，4种农药都保持着较好的回收率，回收率基本维持在86%～105%之间，完全符合农残标准中回收率在70%～120%的要求。从标准偏差来看，溶剂标定量RSD在1.4%～1.9%，而基质标定量RSD在2.4%～2.9%，2种方式定量精密度都相当高。另一方面，这4种农药在0.02 mg/kg 的添加浓度上都具有较好的回收率，说明这4种农药的定量检出下限值≤0.02 mg/kg。

表6 4种农药在添加浓度为0.02～0.48 mg/kg下的平均回收率（n=6）

3 结论与讨论

本文采用Quechers前处理法，结合超高效液相色谱-串联质谱法测定，建立了荔枝中丁虫腈、丁香菌酯、氯啶菌酯、乙唑螨腈农药残留的检测方法。从实验结果看，线性方程、线性范围、标准偏差、添加回收率、检出限量、平行程度、基质效应等都达到了较高水平，符合相关标准要求，且该方法前处理简单、方便快速，具有良好的灵敏度、准确度和精密度，因此是科学有效、可以推广的。鉴于丁虫腈、丁香菌酯、氯啶菌酯、乙唑螨腈作为我国自主研发的农药在国内外都已经注册了相关专利，从目前调查研究和实验结果来看，此4 种农药必将在蔬菜、水果、水稻、棉花等重要农作物上得到大力推广使用，因此，本文具有非常重要的意义，可为其他蔬菜、水果等农产品的农药残留检测提供依据。