盐碱地紫花苜蓿根际土壤真菌多样性分析

王晓春 高婷

(宁夏农林科学院动物科学研究所，宁夏 银川 750000)

紫花苜蓿(Medicago sativaL)属多年生豆科牧草，因其优良的饲用价值和较高的产草量，素有“牧草之王”的美誉。同时因其较强的耐盐碱和固氮能力[1，2]，也是盐碱地改良和修复常选择的草种。根际土壤是植物根系与微生物相互作用的媒介，在根系分泌物与微生物的共同作用下形成的特有的微生物群落结构[3]。真菌是微生物区系的主要成员，参与土壤有机质的转化、养分循环和能量转移，对调节土壤可持续生产力具有重要作用[4]。研究显示，种植紫花苜蓿有利于土壤真菌的生长和繁殖，从而提高真菌丰富度和多样性[5]。张雪等[6]认为，pH与真菌多样性呈显著负相关，pH、电导率和有机质对盐碱地真菌的优势菌属的影响显著。本研究采集宁夏银北种植多年的紫花苜蓿根际土壤，开展ITS真菌高通量测序，分析盐碱地紫花苜蓿根际土壤真菌群落的多样性，为探索土壤可持续利用及盐碱地改良土壤提高理论支持。

1 材料与方法

1.1 样地概况与样品采集

试验采样地位于宁夏银川市西夏区园林场多年生苜蓿种植田，多年多点春季测量pH为8.60，全盐含量为0.56%。于2022年4月10日采土样，选择盐斑颜色最重的苜蓿根际(处理组，LS)及附近裸地(对照组，LCK)采样。每处理3个重复，每个重复采集5株苜蓿根际及对应的非根际土壤。挖取苜蓿主根0～20cm根际土壤，混匀并装入无菌样品采集袋，立即低温条件下带回实验室存入-80℃冰箱保存，用于土壤微生物总DNA提取。

1.2 土壤总DNA提取及ITS基因扩增测序

样品干冰寄送武汉迈维代谢进行土壤样品DNA提取及上机测序。采用Qiagen公司生产的土壤DNA提取试剂盒(天根磁珠法)进行样本DNA抽提。待文库合格后，使用NovaSeq6000进行上机测序。真菌ITS测序区域为ITS1-5F；引物为ITS5-1737F(5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’)和ITS2-2043R(5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’)。

1.3 生物信息学分析

对测序得到的原始数据(Raw Data)进行拼接、质控、过滤后得到有效数据(Effective Tags)。以97%的一致性对有效数据进行OTUs(Operational Taxonomic Units)聚类，并采用Qiime软件(Version 1.9.1)中的blast(http：//qiime.org/scripts/assign_taxonomy.html)[7]与Unit(v8.2)数据库(https：//unite.ut.ee/)[8]进行物种注释。分别在各个分类水平——kingdom(界)，phylum(门)，class(纲)，order(目)，family(科)，genus(属)，species(种)统计各样本的群落组成。

1.4 数据分析

运用Excel对数据进行统计；使用R软件(Version 2.15.3)绘制热图、群落相对丰度柱状图等。

2 结果与分析

2.1 盐碱地紫花苜蓿根际土壤真菌OTUs分析

对盐碱地苜蓿非根际与根际土壤真菌ITS区进行测序，得到原始读数(Raw PE)分别为90231、83039，经拼接、过滤后，最终用于后续分析的高质量序列比例分别为88.77%与91.77%，表明测序质量很好，见表1。在相似度大于97%分类水平下将其聚类为用于物种分类的OTUs。由表1可知，对照组与处理组的OTUs数目接近，分别为642、638，且差异不显著(P>0.05)。

表1 盐碱地苜蓿根际与非根际土壤真菌读数及OTUs数

2.2 盐碱地紫花苜蓿根际土壤真菌群落Alpha多样性

由表2可知，处理组的Shannon指数、Simpson指数相较于对照组分别提高了15.80%、8.33%。但Chao1指数、ACE指数在处理组中低于对照组，但Alpha多样性指数在二者间都差异不显著(P>0.05)。

表2 盐碱地苜蓿根际与非根际土壤真菌Alpha多样性比较

2.3 盐碱地紫花苜蓿根际土壤真菌群落Beta多样性

对盐碱地苜蓿根际与非根际土壤真菌Beta多样性群落构成进行比较，利用Unifrac距离衡量2个样本间的相异系数，其值越小，表示这2个样本在物种构成多样性方面的差异越小。由图1可知，对照组与处理组的距离均大于1.472(Weighted Unifrac距离)、0.543(Unweighted Unifrac距离)，可见对照组与处理组土壤真菌群落构成差异明显。

注：上下2个值分别代表Weighted Unifrac和Unweighted Unifrac距离。图1 盐碱地苜蓿根际与非根际土壤真菌Beta多样性指数热图

图2 门分类水平上的真菌群落组成

2.4 盐碱地紫花苜蓿根际土壤真菌群落组成

OTUs的分类结果表明，处理组与对照组土壤真菌群落隶属于13门50纲120目246科462属。在门水平土壤真菌相对丰度>1%的有子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、被孢霉门(Mortierellomycota)，其中子囊菌门在处理组的相对丰度高于对照组，相对丰度提高了60.44%(P<0.05)。壶菌门在处理组的相对丰度为16.49%，在对照组中仅为0.49%，差异极显著(P<0.01)。担子菌门的相对丰度在处理组(4.52%)中远低于对照组(18.91%)，且差异极显著(P<0.01)。

在属水平下，处理组与对照组的Others相对丰度分别为33.41%、54.97%。除了Others外相对丰度前10的物种群落结构，结果见图3。优势属均为unidentified、根囊壶菌属(Rhizophlyctis)、木霉菌属(Trichoderma)、瓶毛壳属(Lophotrichus)、赤霉菌属(Gibberella)、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、unidentified_Ascomycota_sp、链格孢属(Alternaria)、癣囊腔菌属(Plectosphaerella)，其中，unidentified在处理组与对照组的相对丰度分别为3.72%、17.92%，差异极显著(P<0.01)。根囊壶菌属、木霉菌属、瓶毛壳属、镰孢属、unidentified_Ascomycota_sp在处理组的相对丰度分别为14.20%、13.41%、10.36%、10.89%、2.75%，都显著或极显著高于对照组的0.07%、0.48%、4.85%、4.13%、0.04%。而赤霉菌属、腐质霉属、链格孢属、癣囊腔菌属在对照组的相对丰度为9.03%、3.78%、2.67%、2.06%，高于处理组的7.46%、0.86%、2.10%、0.83%，但差异不显著(P>0.05)。

图3 属分类水平上的真菌群落组成

2.5 盐碱地紫花苜蓿根际土壤真菌LDA差异分析

采用为LEfSe对处理组与对照组真菌进行差异统计分析，找到组间具有统计学差异的生物标记物(Biomarker)。由图4可知，在根际土壤中有9个生物标志物，其中假丝酵母科(Hypocreaceae)、木霉属(g_Trichoderma)、壶菌门(p_Chytridiomycota)、绿木霉(s_Trichoderma_virens)以及4种未命名的子囊菌门下的菌种(f_unidentified_Ascomycota_sp等)和1种子囊菌(s_Ascomycota_sp)是处理组中影响较大的生物标志物。

图4 LDA值分布柱状图

2.6 功能预测

通过FUNGuild功能预测，见图5，腐生营养型(Undefined_Saprotroph)及病理-土壤腐生营养-木质腐生真菌型(Plant_Pathogen-Soil_Saprotroph-Wood_Saprotroph)在处理组的相对丰度分别为42.36%、10.89%，极显著(P<0.01)、显著(P<0.05)高于对照组的9.34%、4.14%。未归类真菌(Unassigned)与病理营养型真菌(Plant_Pathotroph)在对照组相对丰度分别为24.79%、10.69%，低于处理组的61.44%、13.93%，其中未归类真菌在处理组与对照组间差异极显著(P<0.01)。

图5 FunGuild功能注释相对丰度柱形图

3 讨论

3.1 盐碱地紫花苜蓿根际土壤真菌群落多样性分析

土壤微生物群落多样性通常用多样性指数的大小来分析，多样性指数越高则微生物群落多样性越高[9]。本研究显示，盐碱地紫花苜蓿根际与非根际土壤真菌群落Alpha多样性差异不显著，即丰富度和多样性差别不大。但钱雅丽等[5]研究得出，种植紫花苜蓿有利于土壤真菌的生长和繁殖，提高了土壤真菌丰富度。这可能是因为本研究中取样地为多年生紫花苜蓿种植地，苜蓿凋落物等对根际与非根际(附近裸地)的影响较小，从而在丰富度与多样性上差异不显著。

3.2 盐碱地紫花苜蓿根际土壤真菌群落组成分析

本研究中盐碱地苜蓿根际土壤优势菌门为子囊菌门、担子菌门等，这与昆仑山沙区紫花苜蓿根际土壤真菌的优势菌相同[10]。其中根际土壤中的优势菌门子囊菌门、壶菌门相对丰度高于非根际土壤，而担子菌门相对丰度低于非根际土壤。谭海霞等[11]研究表明，施用土壤修复菌剂显著提高了子囊菌门，降低了担子菌门的丰度。可见，种植紫花苜蓿具有与施用修复菌剂相同的作用。这可能是因为子囊菌门能够降解木质素、纤维素等难分解物质，对植物残渣敏感[12]，而苜蓿根际土壤因根系分泌物和残根等，利于子囊菌门在根际土壤的富集。刘震等[13]研究也显示，盐碱地区种植苜蓿可以提高子囊菌门真菌群落相对丰度，降低担子菌门等致病菌的相对丰度，改善土壤养分环境。本研究中壶菌门在根际土壤中的相对丰度约为非根际土壤中的4倍，由此可见，种植苜蓿利于壶菌门真菌富集。本研究中根际土壤中优势菌属根囊壶菌属、木霉菌属、瓶毛壳属等相对丰度显著高于非根际。研究表明，囊根壶菌属真菌多数能分解纤维素和几丁质[14]，是一种在有机质丰富的土壤中生长的腐生菌[15]。可见此类菌在盐碱地苜蓿根际易于生长，这可能得益于根系营养环境优于非根际，也有可能是植物根际病原复杂造成。

3.3 盐碱地紫花苜蓿根际土壤真菌特异菌及生物功能预测

真菌数量虽然在土壤中占比小，但其对于有机质分解和能量循环有着重要的作用，影响着土壤环境质量和植物的生长发育[16]。本研究中，盐碱地紫花苜蓿根际土壤有9个生物标志物，是根际特有的微生物(相较于非根际土壤)，其中有2种属于木霉素。木霉属真菌是一类具有生物防控功能的真菌，可诱导植物提升其对微生物病害的抵御能力，可促进植物生长[17]。广泛用于抑制植物的土传病害。还有5种子囊菌种，属子囊菌门。子囊菌门大多为腐生菌，具有促进土壤养分循环，提高土壤质量的作用[18]。同时FUNGuild真菌功能预测也表明，盐碱地紫花苜蓿根际土壤腐生营养型真菌远高于非根际土壤，而非根际土壤中未归类真菌和病理型真菌高于根际土壤。由此可见，种植紫花苜蓿增加了腐生营养型真菌丰度，增加了盐碱地土壤的有机质，抑制了土传病。

4 结论

本研究采用高通量测序技术研究了宁夏盐碱地紫花苜蓿根际土壤真菌群落特征，结果显示，苜蓿根际土壤真菌优势菌为子囊菌门、担子菌门、壶菌门、根囊壶菌属、木霉菌属、瓶毛壳属。根际土壤中有丝酵母科、木霉属、壶菌门等9个真菌特异菌。FUNGuild真菌功能预测盐碱地苜蓿根际土壤腐生营养型真菌相对丰度高于非根际。可见，种植紫花苜蓿增加了盐碱地土壤的有机质，有抑制了土传病的效果。