靶向表皮生长因子受体免疫PET 显像剂研究进展

张晓君，徐万帮，唐刚华*

表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）在乳腺癌、结直肠癌、头颈部鳞状细胞癌及非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤中存在异常表达，与癌症发生、发展、转移及血管生成密切相关，这使得EGFR 成为抗癌药物研究的热点之一。目前已有多种针对EGFR 的靶向药物用于临床治疗并取得良好的疗效，但仍有一些病人无法从中获益[1]。由于EGFR 的过表达是预估肿瘤侵袭性及放化疗耐药性、判断预后的可靠指标，因此提前筛选对靶向治疗敏感的人群，对于提高疗效和评估预后十分必要。常规的分子病理学手段受取样及肿瘤异质性的限制，难以完整地评估肿瘤EGFR 的表达与变异状况，容易出现假阴性的结果，而免疫正电子发射体层成像（PET）作为一种分子成像技术，以其高度特异性及可重复性显示出独特的优越性[2]。

1 靶向EGFR 免疫PET 的原理及应用

EGFR 又称为ErbB1、HER1，是ErbB 蛋白家族（在人类中被称为HER 家族）的成员之一。它是一种单链的跨膜糖蛋白，由膜外配体结合域、疏水性跨膜域及胞内受体酪氨酸激酶结合域3 个主要结构域组成。EGFR 通过配体诱导的二聚化启动信号级联反应，激活多个下游信号通路，从而促进细胞的增殖、分化、迁移及抑制细胞凋亡[3]。

PET 是分子成像领域的一项新技术，可以对肿瘤组织的代谢和分子表达进行全身性、无创性评估。18F-FDG 作为一种反映细胞代谢情况的葡萄糖类似物，是最早使用且目前临床最常用的PET 显像剂。然而，18F-FDG 无法提供肿瘤分子靶点表达的信息，且基于葡萄糖代谢的显像难以鉴别良、恶性病灶，容易造成假阳性的结果，因此需要特异性更高的显像剂。目前靶向EGFR 的PET 显像剂主要有抗体类、小分子酪氨酸酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors，TKI）类及EGFR 配体3 种。目前常用的TKI 多为喹唑啉衍生物，可与三磷酸腺苷竞争胞内的酪氨酸激酶结构域，从而抑制下游的信号传导通路。然而，TKI 较高的亲脂性可能导致非特异性结合，使显像剂在肝胆系统及腹腔内蓄积，干扰相应部位病灶的成像；且TKI 在血液循环中产生的放射性代谢产物也会影响其放射性分布[4-5]。EGFR 的天然配体具有清除快、肿瘤与非靶器官比值低的缺点，且肝脏对其的高摄取及不良生理反应限制了天然配体的广泛应用。基于抗体类显像剂的免疫PET以正电子核素标记的单克隆抗体及其片段作为显像剂进行显像，可以评估特定抗原靶点在体内的分布与表达。它结合了单克隆抗体高度的靶向特异性及PET 的高敏感度及分辨率的优点，除了作为检测原发肿瘤及转移的工具外，也可对肿瘤进行分期、分型，预测肿瘤对靶向治疗的反应及评估靶向治疗的疗效[6-7]。通过靶向EGFR 的免疫PET 显像，可以在靶向治疗前筛选敏感人群，在治疗过程中监测EGFR 的表达并及时调整治疗方案，有助于临床更精准、合理地用药。

2 免疫PET 常用正电子核素

目前应用于免疫PET 的正电子核素主要以长半衰期核素为主，如89Zr、64Cu、86Y 及124I 等。其中89Zr是最早用于抗体成像的核素，其半衰期（T1/2=78.4 h）与免疫球蛋白的生物半衰期相匹配，具有适用于抗体成像的良好的物理特性。与其他核素相比，89Zr 所产生的正电子能量合适，操作较安全，生产成本低，体内稳定性好，是目前最常用于免疫PET 显像的核素。89Zr 标记的显像剂在注射数天后仍可滞留在肿瘤细胞内，从而呈现出低背景、高对比度的影像[8]。多数89Zr 标记的化合物通过去铁胺（deferoxamine，DFO）与靶向配体螯合，但89Zr-DFO 复合物在体内易解离，产生游离的Zr4+沉积在骨组织中。针对DFO的不足之处，开发出多种由DFO 衍生的螯合剂以解决DFO 的稳定性问题，如DFO*及DFO*与对苯二异硫氰酸盐[-pPhe-NCS（NCS 为其中3 个元素，结构为-N=C=S）] 制备而成的DFO*-pPhe-NCS 等[6]。当前已有部分89Zr 标记的特异性抗体进入临床试验阶段，成功实现了卵巢癌、头颈部鳞状细胞癌、淋巴瘤等肿瘤病灶的可视化。与89Zr 相比，64Cu 的半衰期相对较短（T1/2=12.7 h），因此更适合用于标记抗体片段；由于64Cu 发射的正电子能量低于89Zr，可获得分辨率更好、质量更高的影像。此外，64Cu 还可发射β-射线，故其不仅是一种显像剂，还是一种很有应用前景的治疗性核素。然而，由于64Cu 主要经过肝胆系统清除，可导致肝胆、肠道对显像剂的摄取较高，限制了相应部位及邻近器官组织病灶的检测[6，9]。86Y（T1/2=14.7 h）可作为治疗性核素90Y 的替代物，可较为精确地反映90Y 在体内的生物分布及剂量。124I 虽具有较为合适的半衰期（T1/2=4.2 d），但其在体内的脱卤作用限制了它的临床应用。除了上述长半衰期的核素外，近年来随着各种纳米抗体、亲合体等小分子底物的开发，半衰期更短的68Ga、18F 也开始用于免疫PET 成像，在更快实现诊断性显像的同时可减少病人的辐射吸收剂量[6]。

3 靶向放射性药物

3.1 全长抗体 完整的单克隆抗体具有高靶向亲和力，是最经典的肿瘤靶向EGFR 的治疗药物及免疫PET 放射性核素标记的底物，目前最常用于显像的单克隆抗体包括西妥昔单抗、帕尼单抗以及尼妥珠单抗等。

西妥昔单抗是最早用于PET 显像的单克隆抗体，目前已有利用不同的放射性核素标记西妥昔单抗进行临床前及临床研究。Song 等[10]将西妥昔单抗与双功能螯合基团3,6,9,15-四氮杂双环[9.3.1]十五烷-1(15),11,13-三烯-3,6,9-三乙酸（PCTA）连接，采用标记合成的64Cu-/177Lu-PCTA-西妥昔单抗对EGFR 阳性的食管鳞癌进行免疫PET 成像及放射免疫治疗，实现了肿瘤的诊疗一体化。Benedetto等[11]研究表明89Zr-DFO-西妥昔单抗可用于评估头颈部鳞癌对西妥昔单抗的摄取，并推测其还可用于监测由于EGFR 表达下调导致的化疗耐药。有研究者[12]开展的一项临床研究实现了EGFR 表达的可视化，结果发现在晚期结直肠癌病灶及转移灶中均有89Zr-西妥昔单抗的摄取，且在注射显像剂后第6 天达到最佳的显像效果，但在后续的研究中，89Zr-西妥昔单抗未能预测RAS 野生型的转移性结直肠癌病人的疗效[13]。此外，van Loon 等[14]研究表明，使用89Zr-西妥昔单抗进行成像前需注射未标记的西妥昔单抗使肝细胞的EGFR 预饱和，以期达到令人满意的显像效果。此外，Matsumoto 等[15]设计了一种与西妥昔单抗具有相同氨基酸序列的抗EGFR 单抗NCAB001 并使用64Cu 进行标记，通过腹腔给药的方式成功检测了小鼠胰腺中直径≥3 mm 的小肿瘤病变。

帕尼单抗是一种完全人源性IgG2 抗体，用于治疗难治性、转移性结直肠癌。有临床前研究[2]显示帕尼单抗对EGFR 的亲和力大于西妥昔单抗。Niu等[16]在早期将帕尼单抗与螯合基团1,4,7,10-四氮杂环十二烷-四乙酸（DOTA）结合，并使用64Cu 标记合成的64Cu-DOTA-帕尼单抗未能体现其与肿瘤模型中EGFR 表达之间的相关性，他们推测这可能是肿瘤内部微血管密度低、血管通透性差及显像剂与靶点间存在结合位点屏障等原因所致。后续用89Zr 及86Y 标记帕尼单抗的试验中，显像剂的摄取与肿瘤的EGFR 表达之间表现出了相关性，表明核素标记的帕尼单抗作为显像剂具有良好的特异性及靶向性[17-18]。Lindenberg 等[19]对3 例转移性结直肠癌病人进行的临床研究中也观察到了肿瘤对89Zr-帕尼单抗的特异性摄取，但仍然存在肝脏本底过高、病人接受辐射剂量过大的情况。最近，Hoang 等[20]合成的89Zr-DFO-帕尼单抗在皮下及原位2 种膀胱癌模型中均实现了EGFR 阳性肿瘤的可视化。

与前两种单抗相比，尼妥珠单抗具有更低的皮肤毒性，这说明它在低表达EGFR 的正常组织中结合率更低，对于肿瘤特异性显像更有优势。Chekol等[21]合成的89Zr-DFO-尼妥珠单抗在EGFR 表达的肿瘤中表现出了早期、高度、持续的摄取，而周围正常器官的摄取较低，这使早期肿瘤定位成为可能。除此之外，89Zr-DFO-尼妥珠单抗的有效剂量低于同样方法标记的西妥昔单抗及帕尼单抗，在37 MBq 的人体剂量下，显像剂的预测辐射吸收剂量与18F-FDG相近甚至更低，这使得89Zr-DFO-尼妥珠单抗允许重复扫描及随访检查，有利于随访检测体内EGFR的表达水平。Tang 等[22]后续针对异种移植胶质瘤的研究也表明89Zr-DFO-尼妥珠单抗具有良好的稳定性与靶向性。Solomon 等[23]使用一种名为SpyTag/SpyCatcher 的蛋白共价连接方法，利用显像核素89Zr及治疗性核素225Ac 标记尼妥珠单抗，分别取得了良好的肿瘤靶向显像效果及抑制肿瘤生长的效果，实现了肿瘤的诊疗一体化。

除了上述3 种常用的单克隆抗体外，还有研究者利用核素标记其他靶向EGFR 的单克隆抗体。Tikum 等[24]用89Zr 标记的马妥珠单抗在小鼠体内表现出了良好的肿瘤特异性摄取。且马妥珠单抗与尼妥珠单抗虽同时靶向EGFR，但由于两者结合位点不同，89Zr 标记的马妥珠单抗可动态监测使用尼妥珠单抗进行靶向治疗病人体内EGFR 的表达情况，而不受另一种抗体的干扰。

3.2 抗体片段 尽管基于全长抗体的显像剂在一系列临床前及临床试验中取得良好的结果，但由于全长抗体的分子质量（150 ku）较大，超出肾小球的清除能力，肿瘤摄取及血液清除缓慢，导致标记全长抗体成像具有靶本底比值（T/B）不理想、需重复成像、成本高、病人所受辐射剂量大等缺点，且往往需要数天才能达到最佳的成像效果，不利于临床应用。此外，由于其生物半衰期较长，需要配合半衰期同样长的放射性核素，全长抗体在免疫PET 上的应用也受到限制[6]。

二价抗原结合片段F(ab′)2 由2 个以二硫键结合的抗原结合区组成，相比单价抗原结合片段（Fab）亲和力更高；且F(ab′)2 在保留了全长抗体靶向性高的特点的同时，还具有免疫原性低、血液清除及肿瘤细胞内累积较快的优点[25]，可实现注射后的当天成像。Boyle 等[26]将帕尼单抗的F(ab′)2 片段与1,4,7-三氮杂环九烷基-1,4,7-三乙酸（NOTA）结合，合成的64Cu-NOTA-帕尼单抗-F(ab')2 显示出了较高的亲和力及特异性，且荷瘤鼠肝脏中的放射性摄取要低于完整的帕尼单抗，有助于肝脏病灶的检出。Turker 等[27]发现与18F-FDG 相比，由于64Cu-西妥昔单抗-F(ab′)2 不被炎症组织摄取，更有利于结肠炎背景下的结肠癌病灶的检出，且肿瘤病灶位置与显像剂高摄取区存在解剖学上的相关性。Chakravarty 等[28]研究利用44Sc 及64Cu 标记西妥昔单抗-F(ab′)2 片段在小鼠异位移植的脑胶质瘤及头颈部鳞状细胞癌模型上均体现了靶向性高及全身清除快的特性。近期，Rudd 等[29]开发了一种酶介导的64Cu 及89Zr 标记的抗EGFR Fab528 片段，在注射后3 h 即可获得高质量的影像；且除了快速摄取外，显像剂能在肿瘤细胞内滞留，注射18 h 后肿瘤部位依然观察到相当高的放射性分布。

3.3 亲合体 亲合体分子是一种由58 个氨基酸残基组成的小分子工程支架蛋白，其功能与抗体相似。与单克隆抗体及抗体片段相比，亲合体分子具有分子质量更小（约6.5 ku）、化学稳定性好、特异性及亲和力高的特点，能快速地通过肾脏等排泄器官清除，使影像的敏感度、对比度更高，是一种非常有应用前景的分子探针[8]。

目前研究中常用于成像的靶向EGFR 的亲合体分子主要有ZEGFR:1907及ZEGFR:2377两种。ZEGFR:1907是第2 代亲合体分子，具有良好的亲和力。Zhao 等[30]分别用64Cu 及Alexa680 标记ZEGFR:1907，用于肝癌细胞的PET 显像及近红外荧光成像，结果显示64Cu-DOTA-ZEGFR:1907在高、中表达EGFR 的Hep3B、PLC/PRF/5 肿瘤模型内均有明显的摄取，而在低表达EGFR 的HepG2 肿瘤模型内没有明显摄取，表明基于ZEGFR:1907的PET 显像比光学成像更能区别肝癌肿瘤细胞的异质性。Miao 等[31]设计的18F-FBEM-Cys-ZEGFR:1907以高水平的亲和力与EGFR 阳性的A431 肿瘤细胞结合，且当与45 μg 的Ac-Cys-ZEGFR:1907共同注射时可获得更高对比度的图像。

ZEGFR:2377是靶向EGFR 亲合力最高、被研究最多的亲合体分子[32]。Garousi 等[33]研究合成的89Zr-DFO-ZEGFR:2377在注射显像剂后3、24 h 两个时间点的肿瘤与器官（肾脏除外）比值均高于89Zr-DFO-西妥昔单抗，提示前者具有更高的成像敏感度。Garousi等[34]及Mitran 等[35]先后以57Co 作为55Co 的替代物，合成的57Co-DOTA-ZEGFR:2377表现出良好的靶向性以及优秀的肿瘤与背景比值，即57Co-DOTA-ZEGFR:2377的肿瘤与肝脏比值约为3，较68Ga-DOTA-ZEGFR:2377高7 倍，是目前基于亲合体的显像剂中肿瘤与器官比值最高的。同时，由于预先注射的过量西妥昔单抗能阻断肿瘤细胞的摄取，57Co-DOTA-ZEGFR:2377可用于检测西妥昔单抗治疗期间EGFR 受体的占比情况。Oroujeni 等[36]合成的68Ga-DFO-ZEGFR:2377对比89Zr-DFO-ZEGFR:2377具有更高的肿瘤摄取及肿瘤与背景比值；其肿瘤与肝脏比值虽不如57Co-DOTA-ZEGFR:2377，但由于68Ga 比55Co 更易获得，因此前者更适用于临床对肺、肝及骨骼等部位肿瘤转移灶的检测。Oroujeni等[37]随后尝试用半衰期更长的66Ga（T1/2=9.49 h）标记ZEGFR:2377，在注射24 h 后获得相比68Ga 及89Zr 标记的ZEGFR:2377更高的成像对比度。

3.4 纳米抗体 纳米抗体又称为单域抗体，是骆驼重链抗体的可变区，它是目前最小的抗原结合单位（15 ku），具有容易克隆、亲和力及稳定性高的优点，被称为肿瘤分子成像的“神奇子弹”[38]。由于纳米抗体体积小、肾脏清除快，故在注射1～3 h 内即可对其进行定量检测，从而减轻病人的辐射负担[39]。目前已有数种抗EGFR 纳米抗体被开发用于PET 及单光子发射体层成像（SPECT），如7D12、7C12 及D10等，但尚未有显像剂成功实现临床转化[40]。其中，7D12 是其中唯一用于PET 显像的纳米抗体，Vosjan等[41]合成的68Ga-Df-Bz-NCS-7D12 在裸鼠A431 异种移植模型中取得了高特异性的摄取；与放射性标记单抗相比，纳米抗体成像的肝脏摄取明显降低，而肿瘤的摄取量更高，这表明68Ga-Df-Bz-NCS-7D12 具有优于放射性标记单抗的评估EGFR 表达的潜力。

4 临床应用

作为分子成像技术的一种，免疫PET 显像是一种非常有潜力的诊断工具。它不仅能够从分子水平反映器官组织的功能学特征，且相比常规的18FFDG 显像具有更高的特异性，能够提供特定靶点的信息。对于某些早期18F-FDG 显像阴性而EGFR 表达阳性的肿瘤（如胰腺癌等），靶向EGFR 的免疫PET 显像能提高肿瘤的诊断率，从而通过早期干预改善预后。

除了作为辅助肿瘤诊断的成像工具外，免疫PET 显像还可以通过预测及评估靶向治疗效果，指导肿瘤病人的个体化治疗。在治疗前，可通过免疫PET 筛选EGFR 表达阳性的病人接受相应的抗体治疗；而在治疗后重复的免疫PET 显像可通过对比治疗前后靶点表达的情况，评估肿瘤组织对治疗的反应，有助于调整下一步的治疗方案。Chang 等[18]研究表明，肿瘤对89Zr-帕尼单抗的摄取与其EGFR 的表达存在良好的相关性。有研究者[12]利用89Zr-西妥昔单抗对10 例结直肠癌病人进行了PET 显像评估，发现在6 例存在89Zr-西妥昔单抗的肿瘤摄取的病人中，有4 例病人对西妥昔单抗治疗有所获益，表明89Zr-西妥昔单抗可用于预测西妥昔单抗的疗效。

此外，靶向EGFR 的免疫PET 能对抗癌药物的研发起到指导作用。肿瘤靶向药物的研发是一个复杂的过程，需要消耗大量的时间和经济成本，而靶向EGFR 的免疫PET 可通过可视化抗EGFR 类药物在活体内的药代动力学特征及病灶对药物的摄取，并评估药物的靶向性及特异性，有助于直观地评估抗癌药物的体内特性。且通过提供观察药物的组织分布及可视化靶点表达的信息，靶向EGFR 的免疫PET 有助于药物研发人员优化药物的设计、剂量、给药途径，在临床前阶段预测药物的毒性，并能选择那些从相应药物中最大程度获益的病人，还有利于减少研发时间及降低经济成本[42]。

5 小结与展望

靶向EGFR 的免疫PET 显像利用EGFR 在多种恶性肿瘤中高表达的特点，结合了抗体的高靶向性及PET 显像的高敏感度，是定量、实时监测病人体内EGFR 表达的有效工具。它可以指导肿瘤靶向治疗及药物研发、评估疗效，从而实现肿瘤病人的个体化治疗。针对全长抗体类显像剂分子量过大、血液清除及肿瘤摄取的不足，研究者们开始关注分子质量更小的抗体片段、亲合体分子及纳米抗体类显像剂，它们在克服了全长抗体成像效果不理想、需注射后数日成像及病人所受放射剂量过大等缺陷的同时，保留了全长抗体的高靶向性及特异性的优点。除了与89Zr、64Cu 等显像用核素结合外，上述显像剂还可以与177Lu、90Y 等治疗用核素结合，从而实现肿瘤的诊疗一体化。目前大部分免疫PET 探针仅在少数病人中进行了小范围临床试验，缺乏大规模的临床试验数据，因此需要进行更大样本、多中心的临床评估。

综上所述，靶向EGFR 的免疫PET 显像剂的开发是研究的热点之一，是肿瘤诊疗可靠的辅助工具。相信在不久的将来，靶向EGFR 的免疫PET 显像剂将应用于临床，服务于临床医生及病人。