EB病毒BART miRNAs在胃癌中的作用机制研究进展

王巧祎，王宁宁,2，刘晴晴,2，成 军（.中国人民解放军联勤保障部队第九〇三医院检验科，杭州 3003；2.蚌埠医学院检验医学院，安徽蚌埠 233000）

EB病毒（Epstein-Barrvirus，EBV）又称人类疱疹病毒4型，是一种γ疱疹病毒，它感染了全世界90%以上的人口，并建立了终身潜伏感染。EBV是首个被证明与人类肿瘤发生有关的病毒，尤其与胃癌、鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）、霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和NK/T细胞淋巴瘤等恶性肿瘤的发生、发展密切相关[1]。胃癌是全球第四大常见的癌症，也是癌症相关死亡的第二大原因。其中EBV相关胃癌（EBV-associated gastric carcinoma,EBVaGC）约占所有胃癌病例的10%，具有独特的病理特征和分子特征[2]。EBVaGC多见于EBV潜伏感染I型和潜伏感染Ⅱ型，表达的病毒潜伏期基因有EBV核抗原1（EBV-encoded nuclear antigen 1，EBNA1）、表达EBV编码的RNAs（EBV encoded RNAs，EBERs）、BARTs编码的miRNAs和潜伏膜蛋白2A（LMP2A）[3]。

EBV也是第一个被证明编码miRNA的人类病毒。miRNA是一种含有18～22个核苷酸的非编码小RNA。成熟的miRNA是由miRNA的初级转录本经Drosha和Dicer的顺序加工而形成的[4]。EBV编码miRNA通过完全或不完全的碱基配对与病毒或宿主mRNA的3’-UTR区域结合，诱导靶mRNA降解或者翻译抑制。miRNA的前体分布在EBV基因组的两个区域，BamHI-H右向开放读码框1（BamHI fragment H rightward open reading frame 1，BHRF1）产生3个miRNA前体，生成4个成熟的miRNAs，BART产生22个miRNA前体，生成40个成熟的miRNA[5]。其中BART分成BART cluster 1和BART cluster 2这两个簇。BART cluster 1包含8个miRNA前体，包括BART1，BART3，BART4，BART5，BART6，BART15，BART16和BART17。BART cluster 2包含14个miRNA前体，包括BART2，BART7，BART8，BART9，BART10，BART11，BART12，BART13，BART14，BART18，BART19，BART20，BART21和BART22。BART miRNA在淋巴瘤中的表达相对较低，在NPC和EBVaGC中的表达较高[6]。越来越多的研究表明，BART miRNAs可以通过靶向宿主细胞或病毒的相关基因，抑制基因的表达，在胃癌的发生发展中发挥重要的调节作用，包括维持病毒潜伏感染、细胞转移、细胞凋亡、细胞增殖、免疫逃逸甚至放化疗敏感性，见表1。本文的目的是对BART miRNAs在EBVaGC发生发展中的作用机制进行总结，为胃癌患者寻找潜在的治疗靶点提供新思路。

1 BART miRNAs对胃癌细胞增殖转移的影响

部分研究表明BART miRNA在胃癌细胞的增殖转移中起促进作用。例如，EBV-miR-BART3-3p和EBV-miR-BART11分别靶向TP53[7]和FOXP1[8]促进胃癌细胞增殖。EBV-miR-BART10-3p，EBVmiR-BART11，EBV-miR-BART17-5p和EBV-miRBART1-3p分别靶向DKK1[9]，FOXP1[10]，KLF2[11]和DAB2[12]促进胃癌细胞转移。然而，并不是所有BART miRNA都能促进胃癌细胞的增殖或转移，部分研究表明BART miRNA在胃癌细胞的增殖转移中起负调控的作用。EBV-miR-BART1-5p，EBV-miR-BART2-3p和EBV-miR-BART11-3p分别靶向GCNT3[13]，ULK1[14]和eIF4E[15]均抑制了胃癌细胞的迁移生长。此外，某些BART miRNA靶向不同的宿主基因却能起到相反的调控作用，靶向DAB2促进胃癌迁移的EBV-miR-BART1-3p，它在靶向E2F3后却诱导了胃癌细胞G0/G1期停滞，抑制了胃癌细胞的增殖[16]。BART miRNA影响胃癌细胞的增殖转移能力，因此，通过人为干预BART miRNA的表达可能可以抑制胃癌的发生发展，最终达到治疗的目的。

2 BART miRNAs靶向促凋亡基因/抗凋亡基因

细胞凋亡是指机体为了维持内环境的稳态，在基因的调控下，细胞产生主动、有序的死亡。细胞凋亡由促凋亡基因和抗凋亡基因共同调控。促凋亡蛋白包括BAD，BID，BIM，PUMA，BAX和BAK等，它们介导细胞色素C从线粒体释放到细胞质，激活Caspase的级联反应，在诱导细胞凋亡的过程中起到了重要的作用。研究显示EBV-miR-BART5通过靶向抑制促凋亡蛋白PUMA，抑制胃癌细胞凋亡，促进细胞存活[17]。EBV-miR-BART4-5p靶向促凋亡蛋白BID在EBVaGC细胞中发挥抗凋亡作用[18]。抗凋亡基因包括BCL2，BCL2L2，DDX42和BRUCE等，BART miRNA也可以靶向一些凋亡抑制剂诱导细胞凋亡。例如，EBV-miR-BART15-3p通过靶向凋亡抑制剂BRUCE诱导胃癌细胞凋亡，抑制了胃癌细胞的增殖[19]。这说明BART miRNA可以通过靶向下调这些与凋亡相关的基因，影响胃癌细胞凋亡，改变胃癌细胞的结局。

3 BART miRNA参与信号通路

胃癌中miRNA参与Wnt/β-catenin，PTEN/PI3K/AKT，JAK/STAT，NF-κB等多种信号通路的调控[20-24]。Wnt信号通路在组织胚胎发育、组织内环境稳态以及肿瘤中发挥重要作用[25]，研究表明EBV-miR-BART10-3p和EBV-miR-BART22同时靶向APC和DKK1，激活Wnt信号通路，促进EBVaGC细胞增殖、迁移和侵袭[26]。NF-κB信号通路在肿瘤性炎症中起关键作用[27]，EBV-miRBART11可以通过靶向FOXP1激活NF-κB信号通路诱导肿瘤相关巨噬细胞的分化，增强肿瘤局部炎症反应，促进胃癌细胞增殖[8]。BART miRNA参与信号通路的调节，通过激活或抑制相应的信号通路可以改变胃癌细胞的表型，从而发挥促进或者抑制胃癌发生发展的作用。

4 BART miRNA诱导宿主基因甲基化

DNA甲基化是肿瘤最常见的表观遗传调控机制之一，它通常发生在富含CpG岛的启动子区域，正常情况下该区域处于非甲基化状态，在癌细胞中该区域发生甲基化阻碍了转录因子与启动子结合，从而导致基因转录水平降低或转录沉默。相较于EBV阴性胃癌细胞（EBV-negative gastric carcinoma，EBVnGC），高甲基化在EBVaGC中更加普遍。宿主基因高甲基化是EBVaGC一个独特的分子特征，也是导致基因转录沉默的潜在机制。其中，PIK3CA，ARID1A和CDKN2A基因启动子在EBVaGC中甲基化的比例较高。有研究证实BART miRNA如EBV-miR-BART19-3p也可以诱导宿主基因WIF1，NLK和APC的启动子发生甲基化，增强Wnt通路的活性，促进细胞的增殖能力，抑制细胞的凋亡能力[28]。这提示BART miRNA诱导某些宿主基因的高甲基化会促进EBV感染的胃癌细胞恶性生长，应用去甲基化剂5-氮杂胞苷可能可以成为治疗的策略。

5 BART miRNA与EMT相关

上皮-间充质转变（epithelial to mesenchymal transition，EMT）的主要过程是上皮细胞通过特定程序转化为间充质样细胞，上皮细胞丧失极性，中断了细胞与细胞之间的黏附作用，从而获得了较高的转移能力。细胞间的黏附作用是由E-cadherin维持的，在EMT过程中，E-cadherin在Snail，Twist，ZEB1和ZEB2等转录因子的介导下转变为N-cadherin。BART miRNA靶向EMT相关蛋白在EBVa-GC中发挥作用，TSAI等[29]人的研究表明EBVmiR-BART9直接靶向EMT相关蛋白E-cadherin，下调miR-200a和miR-141的表达，从而促进胃癌细胞的增殖和侵袭能力。LI等[30]人的研究表明EBV-miR-BART12直接靶向EMT诱导物Snail，诱导G2/M期停滞，促进胃癌细胞凋亡，抑制细胞的增殖和迁移。此外，BART miRNA也可以影响EMT过程，研究表明EBV-miR-BART12与TPPP1结合并下调它的表达，进而抑制α-tubulin的乙酰化，促进微管的动态组装，重塑细胞骨架，增强β-catenin的乙酰化。β-catenin激活EMT过程，从而促进胃癌细胞的侵袭和迁移[31]。EBV-miR-BART6-3p可以靶向和下调一种长非编码RNA（long non-coding RNA，LncRNA）LOC553103，逆转EMT过程抑制胃癌细胞的迁移和侵袭[32]，LOC553103可以直接结合STMN1 mRNA的3’-UTR区调节细胞周期相关蛋白，从而抑制胃癌细胞的增殖[33]。了解EMT相关BART miRNA的作用有助于进一步探索其在胃癌中潜在的治疗价值。

6 BART miRNA削弱免疫系统的攻击

肿瘤免疫逃逸对肿瘤的生存和发展至关重要，这有助于它们避免被免疫系统识别和攻击。PD-L1过表达是EBVaGC一个独特的分子特征。EBVaGC通过PD-L1/PD-L1通路逃避T淋巴细胞的免疫监视[34]。PD-L1在胃癌细胞表面形成屏障，与T细胞表面受体PD-L1相互作用，从而抑制T细胞的毒性。WANG等[35]人研究表明EBV-miR-BART11和EBV-miR-BART17-3p分别通过靶向FOXP1和PBRM1来上调PD-L1的表达，从而促进胃癌的免疫逃逸。SYOON等[36]人的研究表明EBV-miRBART5-5p直接靶向PIAS3，并通过EBV-miRBART5-5p/PIAS3/pSTAT3/PD-L1途径调控，有助于EBV相关胃癌细胞抗凋亡、增殖、侵袭、迁移和免疫逃逸，最终促进胃癌发生发展，恶化临床结果。这使PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂作为EBVaGC的潜在治疗方法成为可能。

7 BART miRNAs改变胃癌细胞对化疗的敏感性

目前，对EBVaGC的治疗尚无特殊的方法，手术切除是大多数患者获得根治的唯一可能方法，手术与一般胃癌相同，且术后容易复发。所以，联合放化疗仍是胃癌有效的治疗手段，胃癌对放化疗的耐药性是胃癌难以治疗的重要原因。耐药性的潜在机制十分复杂，有研究表明miRNA通过影响药物外排、细胞凋亡、自噬、EMT、癌症干细胞（cancer stem cells，CSCs）和细胞周期等胃癌细胞功能调节胃癌对化疗药物的敏感性[37-38]。已经观察到BART miRNAs的异常表达可以改变胃癌细胞对化疗的敏感性，EBV-miR-BART20-5p通过直接靶向BAD增加了对5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）和多西紫杉醇的耐药性[39]。EBV-miR-BART15-3p通过靶向TAX1BP1增加了胃癌细胞对5-FU的化学敏感性[40]。TP53可以被EBV-miR-BART5-3p直接靶向抑制，下调对化疗药物敏感和诱导电离辐射的p53的表达，最终导致加速细胞周期进程，抑制细胞凋亡[6]。总之，BART miRNA的异常表达可能改变药物反应，甚至逆转细胞耐药，改善患者的不良预后。

8 BART miRNA调节EBV编码的基因

BART miRNA可以调节EBV编码基因的表达。EBV有潜伏期和裂解期两种状态，BRLF1和BZLF1这两个EBV编码的立即早期基因与EBV感染由潜伏期向裂解期转变密切相关[41]。研究发现EBV-miR-BART20-5p通过抑制BAD介导的caspase-3依赖性细胞凋亡，间接抑制EBV即刻早期基因BRLF1和BZLF1的表达，在维持EBV相关胃癌的潜伏期和肿瘤持续性发展中发挥重要作用[42]。EBV潜伏膜蛋白LMP1在EBVaGC中不表达，EBV-miR-BART16在EBVaGC中表达丰富，ZHANG等[43]人的研究表明EBV-miR-BART16可能是LMP1在EBVaGC表达缺失的原因，它的表达抑制了细胞的增殖和存活。这表明，BART miRNA与某些EBV编码基因具有拮抗作用，它们之间互相形成复杂的调控网络，影响胃癌的进展，但具体机制仍需进一步研究阐明。

9 展望

近年来，BART miRNA在EBVaGC中的致病机制已经受到了越来越多的关注，并且取得了许多重大的进展。然而同时存在一些问题：①EBV与胃癌和NPC等上皮细胞肿瘤密切相关，部分BART miRNA例如EBV-miR-BART8-3p[44]和EBVmiR-BART13-3p[45]已经被证实可以在NPC中促进肿瘤的发生发展，但是它们在胃癌中的作用尚未见报道，还有待于进一步研究;②不同的BART miRNA靶向同一种宿主基因起到的作用不同，同一种BART miRNA靶向不同宿主基因起到的作用也不相同，它们之间存在着复杂的调控网络，深入研究具体的调控机制对科研工作者仍是一个巨大的挑战;③BART miRNA与EBVaGC治疗的关系均停留在基础研究阶段，在应用于临床之前仍需要进行大规模实验来进行验证。胃癌的转移是胃癌患者死亡的主要原因，这给胃癌的临床治疗带来了很大的困难。目前尚无胃癌的靶向治疗药物，对BART miRNAs在EBVaGC中的作用机制的总结有助于理解肿瘤转移的分子机制，可以为EBVaGC的靶点治疗提供新的线索。BART miRNA有望成为胃癌潜在的诊断或预后的生物标志物，也可能成为EBVaGC免疫治疗的重要靶点。