中国14家实验室基于同位素稀释质谱法检测人血清同型半胱氨酸水平的能力验证

黄 冰，迟 晨，蒋玉新，洪 沫，曹 冉，崔 丽，曹云峰（.大连博源医学检验实验室有限公司质量部，辽宁大连 6000；.上海市生物医药技术研究院国家卫生健康委员会计划生育药具重点实验室，上海 0003）

同型半胱氨酸 (homocysteine，Hcy) 是用于心脑血管等疾病检测的常规项目[1-3]，随着质谱方法的发展，使用同位素稀释液相色谱串联质谱法（isotope dilution-liquid chromatography/tandem mass spectrometry，ID-LC/MS/MS)检测Hcy的实验室数量也逐渐增加，各实验室间结果的可比性成为了质谱检测的主要挑战。

能力验证 (proficiency testing，PT) 是能力验证组织者 (proficiency testing provider，PTP) 组织的，利用实验室间比对，按照预先制定的准则评价参加者能力的活动。PT对于发现检测中存在的共性及特殊问题[4-8]、实现不同实验室间结果互认具有重要意义[8-10]。基于上述背景，本单位开展基于IDLC/MS/MS的“人血清中同型半胱氨酸测定能力验证”活动，对各参加实验室的结果进行评定，并提出改善建议。

1 材料与方法

1.1 实验室 本研究对象为分布在9个省份10个城市的14家质谱检测实验室。

1.2 仪器与试剂 液相色谱串联质谱仪（爱博才思）；微量移液器（艾本德）；磁力搅拌器（アズpeas株式会社）；多管涡旋混合仪（美国莱博特）；恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司）；高速冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；天平（上海天美天平仪器有限公司）；甲醇，乙腈 (Merck)；甲酸 (Sigma-Aldhich)；二硫苏糖醇(Macklin)；同型半胱氨酸 (CATO)；同型半胱氨酸-D4 (CIL) 。

1.3 方法

1.3.1 样本采集与制备：收集健康志愿者的血清基质150ml用于制备能力验证样品。根据初测值将不同来源的血清基质分为高低二种浓度 (样品A，样品B，μmol/L)，分别充分混合、搅拌、静置后分装至无菌冻存管，规格为0.5ml/支。粘贴标签后储存于-70℃冰箱。

1.3.2 样品均匀性：从样品总体中随机抽取每种浓度样品10个，采用ID-LC/MS/MS法将每个样品重复测量2次；为防止漂移，2次测量按随机次序进行。参考CNAS-GL003《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》[11]，采用单因素方差分析法对检验结果进行统计处理；P>0.05时认为能力验证样品均匀。

1.3.3 样品稳定性：考察能力样品在冻融1次、-20℃&50天、干冰运输90h 3个条件下稳定性，从每种浓度包装单元中随机抽取各条件下的样本3个以上，采用ID-LC/MS/MS法将每个样品重复测量2次，以均匀性检验结果为第1次稳定性数据进行t检验。P>0.05时认为能力验证样品在该条件下稳定。

1.3.4 样品发放与检测：每个实验室随机发放2种浓度的样品各1支。样品用泡沫盒加装干冰运输，到达参加实验室后立即置于-20℃保存。样品开封后，各实验室应按照《参试指导书》要求尽快检测。

1.3.5 能力评定：参考CNAS-GL002 《能力验证结果的统计处理和能力评价指南》[12]及GB/T28043-2019《利用实验室间比对进行能力验证的统计方法》[6]进行能力评定。由参加实验室的公议值确定指定值，指定值的不确定度不可忽略时，采用能力评定统计量Z’比分数进行能力评定。评定原则为：|Z’|≤2时“满意”；2＜|Z’|＜3时“可疑”；|Z’|≥3时“不满意”。

1.4 统计学分析 采用单因素方差分析法和t检验法分别对能力验证样品进行均匀性和稳定性评价。采用格拉布斯检验法识别离群值，要求离群值的数量不超过总数量的20%。采用稳健算法A计算指定值和能力评定标准差[13]。使用EXCEL编制模板，验证后完成计算。

2 结果

2.1 样品均匀性 见表1。采用单因素方差分析时，在α=0.05的检验水准下，样品A和样品B均满足均匀性要求。

表1 同型半胱氨酸均匀性检验

2.2 样品稳定性 见表2。采用t检验时，在α=0.05的检验水准下，样品A和样品B在稳定性检验条件下均满足稳定性要求。

表2 同型半胱氨酸稳定性检验

2.3 能力验证结果 回报结果的14家参加实验室反馈结果良好，没有粗大误差和异常值，参加实验室结果统计量结果见表3；能力评定统计量见表4。根据能力评定原则，参加实验室二种浓度检测结果均为满意，满意率为100%。

表3 参加实验室结果统计量汇总

表4 能力评定统计量

3 讨论

由于时效、经济、方法学要求、指标适用范围、信息不畅等原因，部分实验室参加PT活动的可及性较差[14]。培养有能力在ISO/IEC 17043体系运行下，组织部分常规项目PT活动的PTP，可有效缓解临床检验中心压力、增加检测实验室参加频次、保障患者权益[15-17]。

明确要求同位素稀释液相色谱串联质谱法（ID-LC/MS/MS)是本轮PT的一大创新，也是对现有需求缺口的补充[18-19]。本轮PT参加实验室数量和实际回报结果数量均较少，数量不足容易产生极端能力评定结果，使能力验证效力下降[14,20]，为PTP组织PT带来了极大的挑战。经综合分析，参加实验室数量较少的原因有以下4条：①质谱法在医学检验界的应用有待普及；②参加实验室对PT活动的重要性认识不够；③PTP组织PT活动的经验不足；④参加实验室对非政府性质PTP的信任度不够。针对上述问题，PTP需要优化专业人才布局，在PT活动运行中不断积累经验，提升自己的技能，如改进质量管理体系、保证计划运作质量、提供更专业的指导意见等。此外可借力权威平台如中国合格评定国家认可委员会（China National Accreditation Service for Conformity Assessment，CNAS）机构、研究院等，加大对外宣传力度，提高PTP知名度，使各实验室认识到PT的重要性。

参加实验室使用ID-LC/MS/MS法检测人血清中同型半胱氨酸的满意率为100%。在排除偶然因素后对各实验室的原始记录进行分析，发现部分实验室存在色谱峰未保留的情况；虽然未对评定结果造成影响，但变异度较高，因此仍建议实验室选择合适的色谱柱和洗脱条件，以保证Hcy具有适宜的保留时间，实现杂质分离。