智三针疗法对PSCI大鼠学习和记忆能力的影响

翁瑜君 陈志宁 梁伟海 余永森 林国伟 唐梁 刘晓俊

广州市第一人民医院中医科，广州 510180

脑卒中后认知功能障碍（PSCI）属于血管性认知功能障碍范畴［1］。根据2020 年《中国卒中报告》，中国卒中患病率为1 114.8/10万，病死率为149.49/10万［2］。大型国际队列研究在近期的报道则显示，发生卒中后的幸存者在10 年内PSCI 患病率高达61%［3］，而且卒中患者中，伴有认知功能障碍者，其病死率明显升高。因自理能力减退，PSCI患者生存质量也随之下降，家庭及社会也面临较大负担。PSCI 病因和发病机制较为复杂，根据我国现有的医疗资源，现代医学治疗该病，重点在控制危险因素和改善认知两方面，以药物治疗为主［3-8］，但认知功能改善方面疗效不甚理想。因此，积极寻求有效疗法，使该疾病得到有效救治，具有较大意义。中医理论认为，PSCI 病因病机为髓海不足，脑失所用。我国知名针灸学家靳瑞创建岭南代表性“靳三针疗法”，其中“智三针”具有补髓充脑、开窍益智的作用，该疗法取穴少、易于操作、治疗费用低，主要用于治疗各种类型的认知障碍。同时通过文献研究，智三针对PSCI 的相关研究报道较少［15-21］。因此，本实验运用智三针疗法治疗PSCI大鼠，通过Morris 水迷宫实验，观察经智三针疗法干预后，各组大鼠逃避潜伏期及游泳距离的变化，评价3 组大鼠在干预前及干预后的学习能力和记忆能力。分析智三针疗法对改善PSCI 大鼠学习能力及记忆能力的疗效，为智三针疗法的临床应用提供实验参考。

材料与方法

1.材料

1.1.实验动物 2022 年8 月2 日至10 月3 日进行动物实验研究。本实验动物由广州辉园苑医药科技有限公司科研部动物实验中心提供。用SPF 级体质量（305.19±12.44）g的SD 雄性大鼠45 只，所有大鼠均在湿度30%～50%，温度21～23 ℃，模拟日夜系统的温室下自由饮食饲养3 周。大鼠摄食稳定，体质量稳步增加。

1.2.实验针灸器具 本实验智三针疗法采用东邦牌毫针，型号为0.3 mm×25.0 mm，从江苏东邦医疗器械有限公司采购。

1.3.仪器 大鼠脑立体定位仪（北京铭泰佳信科技有限公司）；Morris水迷宫设备（江苏赛昂斯科技有限公司）。

2.方法

2.1.分组及PSCI 大鼠模型的制备 实验大鼠在适应性饲养3 周后，随机分为3 组，假手术组、PSCI 大鼠对照组、智三针疗法组，各15只。在造模前6 d均行Morris水迷宫实验评定各组大鼠学习及记忆能力。⑴PSCI大鼠对照组及智三针疗法组：使用大脑中动脉栓塞（MCAO）［9-10］法制备PSCI大鼠模型，并于术后第3 天用Morris 水迷宫实验检验PSCI 大鼠模型。⑵假手术组：将大鼠麻醉，切开手术部位皮肤后，立即缝合，不进行MCAO 步骤。⑶造模方法：采用MCAO 法造模。大鼠造模前禁食12 h，禁水4 h，0.5 %戊巴比妥钠麻醉，颈部备毛、消毒，做正中切口，分离右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，结扎相关动脉，用线栓经颈内动脉插入大脑中动脉的方式制造脑缺血及缺血再灌注状态。完成操作后，缝合颈部伤口，进行常规饲养。⑷造模成功标准：与假手术组对比，PSCI 大鼠对照组及智三针疗法组大鼠逃避潜伏期明显延长，游泳距离明显增长。

2.2.针灸干预 在采用MCAO 法造模术后第3 天，应用Morris 水迷宫实验检测各组大鼠学习和认知能力，并在Morris 水迷宫实验结束后第1 天，分别对各组大鼠进行干预。智三针疗法的穴位由神庭穴及两侧本神穴组成。参照《实验针灸学》［11］大鼠腧穴定位，神庭穴：在大鼠两眼连线中点头正中线上2 mm凹陷处；本神穴：在神庭穴与耳根连线的内1/3 处。采用规格0.3 mm×25.0 mm 的毫针在穴位平刺进针8 mm，用捻转手法，以90°捻转刺激，捻转速度60 次/min。持续刺激2 min 后，休息3 min，如此反复，总共操作15 min，1 次/d，共持续21 d。PSCI 大鼠对照组及假手术组：给予智三针疗法组大鼠同样的抓取、固定、取穴、消毒操作，但是不进行针刺治疗。

2.3.Morris水迷宫实验步骤 本实验在造模前6 d、造模后3 d 及针灸干预结束后1 d 进行Morris 水迷宫实验［12-13］。⑴定位航行实验。实验前1 d，先将大鼠放入水迷宫装置中适应性游泳，然后分别在装置的4 个象限对大鼠进行入水及寻找平台训练，每天每只大鼠训练4次，共持续4 d。记录大鼠在1 min内寻找到并登上平台的时间即为逃避潜伏期。⑵空间探索实验。在定位航行实验结束后第2 天，撤离平台，大鼠随机点入水，通过对其游泳的轨迹计算寻找到平台时总的游泳距离。

3.统计学分析

数据分析采用SPSS 19.0 统计软件，符合正态分布的计量资料采用均数±标准差（±s）表示，计量资料多组间比较用方差分析，LSD-t检验进行组间两两比较，自身对照采用配对t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1.大鼠一般情况

实验开始时共45只大鼠，MCAO法造模过程中，智三针疗法组死亡3 只，PSCI 大鼠对照组死亡2 只，假手术组死亡2 只。术后恢复及针灸干预过程中，智三针疗法组死亡0 只，PSCI 大鼠对照组死亡2 只，假手术组死亡1 只。最终各组大鼠数为智三针疗法组12 只、PSCI 大鼠对照组11 只、假手术组12只。

2.大鼠体质量变化（表1）

表1 3组大鼠干预前后体质量变化比较（g，± s）

表1 3组大鼠干预前后体质量变化比较（g，± s）

注：PSCI为脑卒中后认知功能障碍

组别智三针疗法组PSCI大鼠对照组假手术组F值P值只数12 11 12干预前302.1±18.1 310.1±20.5 306.1±23.9 2.550 0.075干预后353.1±22.3 369.1±34.1 360.1±28.7 2.320 0.104 t值1.238 1.571 1.484 P值0.231 0.133 0.180

干预前（第1天）及干预后，3组大鼠体质量比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）；通过t检验分析，3组大鼠在同组干预前后体质量增长无明显差别，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

3.各组大鼠造模前后Morris水迷宫实验结果（表2）

表2 3组大鼠造模前后Morris水迷宫实验结果（± s）

表2 3组大鼠造模前后Morris水迷宫实验结果（± s）

注：PSCI为脑卒中后认知功能障碍；与假手术组比较，aP＜0.05；与PSCI大鼠对照组比较，bP＞0.05

组别智三针疗法组PSCI大鼠对照组假手术组F值P值只数12 11 12逃避潜伏期（s）造模前/假手术前37.32±6.19 35.90±6.08 37.66±7.02 2.210 0.093造模后/假手术后51.94±8.19ab 53.13±6.28a 41.66±6.65 4.060 0.022 t值2.713 2.692 1.478 P值0.026 0.029 0.183游泳距离（cm）造模前/假手术前623.52±42.22 629.36±39.87 617.96±45.60 2.190 0.092造模后/假手术后1 242.25±100.72ab 1 192.28±137.72a 702.92±85.60 4.240 0.017 t值2.208 2.276 1.372 P值0.046 0.044 0.195

造模前6 d，3 组大鼠逃避潜伏期、游泳距离比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05），这提示造模前3 组大鼠的学习能力及记忆力无明显差别。造模后3 d，3 组大鼠逃避潜伏期、游泳距离差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与假手术组比较，PSCI大鼠对照组、智三针疗法组大鼠的逃避潜伏期及游泳距离均明显延长，差异均有统计学意义（t=2.228、2.219、2.304、2.343，均P＜0.05）；与PSCI大鼠对照组比较，智三针疗法组大鼠的逃避潜伏期、游泳距离差异均无统计学意义（t=1.630、1.866，均P＞0.05）。造模后3 d 与造模前6 d比较，智三针疗法组、PSCI大鼠对照组的逃避潜伏期和游泳距离均有增长，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与假手术前比较，假手术后大鼠的逃避潜伏期、游泳距离均无变化，差异无统计学意义（P＞0.05）。

4.各组大鼠在针灸干预前后的Morris 水迷宫实验结果（表3）

表3 3组大鼠在针灸干预前后的Morris水迷宫实验结果（± s）

表3 3组大鼠在针灸干预前后的Morris水迷宫实验结果（± s）

注：PSCI为脑卒中后认知功能障碍；与假手术组比较，aP＜0.05；与PSCI大鼠对照组比较，bP＜0.05

组别智三针疗法组PSCI大鼠对照组假手术组F值P值只数12 11 12逃避潜伏期（s）干预前51.94±8.19 53.13±6.28 41.66±6.65 4.060 0.022针灸干预后45.64±7.70ab 56.33±10.32a 39.17±5.35 4.270 0.016 t值2.245 1.602 1.370 P值0.045 0.117 0.197游泳距离（cm）干预前1 242.25±100.72 1 192.28±137.72 702.92±85.60 4.240 0.017针灸干预后887.35±92.47ab 1 292.29±104.52a 621.33±56.41 4.320 0.015 t值2.211 1.681 1.824 P值0.046 0.108 0.075

智三针疗法组大鼠针灸干预后逃避潜伏期与针灸干预前比较明显缩短，游泳距离明显减少，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；干预后，PSCI 大鼠对照组、假手术组大鼠的逃避潜伏期、游泳距离与干预前比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。针灸干预结束后1 d，3组大鼠的逃避潜伏期、游泳距离差异均有统计学意义（均P＜0.05）；与假手术组比较，PSCI 大鼠对照组、智三针疗法组大鼠的逃避潜伏期、游泳距离均延长，差异均有统计学意义（t=2.508、2.482、2.473、2.318，均P＜0.05）；与PSCI 大鼠对照组比较，智三针疗法组大鼠的逃避潜伏期缩短，游泳距离明显减少，差异均有统计学意义（t=2.261、2.201，均P＜0.05）。

讨论

对于中风记载最早出现在《黄帝内经》中，如对昏迷、半身不遂等有“仆击、大厥、偏风”等描述。根据主要临床表现，“卒中后认知障碍”可归属为“呆病、善忘”等病症。脑主元神是精神意识的主宰。我国知名针灸学家靳瑞在长期性的临床实践及科学研究过程中，创建岭南代表性“靳三针疗法”［19］。其中“智三针”由神庭和本神穴组成，主要用于治疗各种认知障碍，前期已有研究均提示其对血管性认知功能障碍疗效显著［15-21］。目前，中医界认为PSCI 的病因病机为髓海不足，脑失所用。其证候特征：虚证则以精气亏虚，脑失所养；实证则以痰及瘀为主，痹阻脑窍。据此，笔者认为，神庭穴属于督脉，督脉入络脑；本神穴属足少阳胆经穴位。本，人之根本，是头部元神所在之处，主治神志病。针刺二穴可以起到补髓充脑，开窍益智的作用，适合用于PSCI 治疗。通过文献研究，智三针对PSCI 的相关研究及报道较少，加上智三针穴位组成较少，可以在大鼠上找到相应穴位，进行动物实验的可行性较大［11，15-21］。基于此，本实验开展智三针疗法对PSCI 大鼠的学习能力和记忆能力的疗效观察，为该疗法的临床应用提供实验参考。

本研究应用Morris 水迷宫实验评定大鼠学习和记忆的能力。20 世纪80 年代初，英国心理学家Morris 设计出Morris 水迷宫，用于大脑的学习和记忆功能研究。此后，Morris 水迷宫系统被广泛运用在神经生物学领域的相关研究。目前，Morris水迷宫实验是世界公认的评价学习记忆的方法，主要实验动物是大鼠和小鼠。Morris水迷宫实验测试程序主要包括定位航行试验和空间探索试验。定位航行试验记录逃避潜伏期，反映动物的学习能力；空间探索试验记录游泳轨迹及距离，反映动物的记忆能力［12］。

Morris水迷宫实验中，逃避潜伏期越短，学习能力越强；游泳距离越短，记忆能力越强。本研究显示，MCAO 法造模后，智三针疗法组、PSCI大鼠对照组大鼠的逃避潜伏期及游泳距离较造模前均有增长。假手术组大鼠未进行MCAO 法操作，其学习能力及记忆能力较假手术前无变化。同时，造模后，与假手术组对比，智三针疗法组、PSCI 大鼠对照组大鼠的逃避潜伏期及游泳距离均明显延长（均P＜0.05），且智三针组和PSCI 大鼠对照组对比，两组大鼠的学习能力及记忆力无明显差别（均P＞0.05），这提示造模成功。针灸干预后，智三针疗法组大鼠的逃避潜伏期及游泳距离与干预前对比显著缩短（均P＜0.05），同时较PSCI 大鼠对照组的逃避潜伏期及游泳距离也显著缩短（均P＜0.05）。

大鼠在卒中后认知障碍状态下，经过智三针疗法干预，在学习能力及记忆力方面都有改善，这提示智三针疗法对PSCI 大鼠有一定疗效。基于该项研究结论，后续将尝试进一步从胆碱能通路角度观察智三针疗法对PSCI 大鼠的作用靶点和疗效机制。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明 翁瑜君：酝酿和设计试验，实施研究，起草文章，统计分析；陈志宁：实施研究，采集数据；梁伟海：分析/解释数据；余永森：酝酿和设计试验，对文章的知识性内容作批评性审阅，统计分析；林国伟：采集数据；唐梁：酝酿和设计试验，对文章的知识性内容作批评性审阅，指导；刘晓俊：对文章的知识性内容作批评性审阅，行政、技术或材料支持，指导，支持性贡献